В молекулярной биологии и генетике блоттинг — это метод переноса больших биомолекул ( белков , ДНК или РНК ) на носитель, например, мембрану из нитроцеллюлозы , поливинилиденфторида или нейлона . Во многих случаях это делается после гель-электрофореза , перенося молекулы из геля на блоттинг-мембрану , а в других случаях — добавляя образцы непосредственно на мембрану. После блоттинга перенесенные молекулы визуализируются с помощью окрашивания красителем (например, окрашивания белков серебром), авторадиографической визуализации радиоактивно меченых молекул (выполняется перед блоттингом) или специфической маркировки некоторых белков или нуклеиновых кислот . Последнее делается с помощью антител или гибридизационных зондов , которые связываются только с некоторыми молекулами блота и имеют присоединенный к ним фермент . После надлежащей промывки эта ферментативная активность (и, следовательно, молекулы, обнаруженные в пятне) визуализируется путем инкубации с соответствующим реагентом, что приводит либо к образованию окрашенного осадка на пятне, либо к хемилюминесцентной реакции, которая регистрируется фотопленкой .
Саузерн -блоттинг — это метод, который обычно используется в молекулярной биологии для обнаружения определенной последовательности ДНК в образцах ДНК. Саузерн-блоттинг сочетает перенос разделенных электрофорезом фрагментов ДНК на мембрану фильтра и последующее обнаружение фрагментов путем гибридизации зонда. [1]
Вестерн -блот используется для обнаружения специфических белков в сложных образцах. Сначала белки разделяются по размеру с помощью электрофореза, а затем переносятся на соответствующую матрицу для блоттинга (обычно поливинилиденфторид или нитроцеллюлозу ) и затем обнаруживаются с помощью антител.
Подобно вестерн-блоттингу , дальне-вестерн-блоттинг использует белок-белковые взаимодействия для обнаружения присутствия определенного белка, иммобилизованного на матрице блоттинга. Затем антитела используются для обнаружения присутствия белок-белкового комплекса, что делает дальне-вестерн-блоттинг особым случаем вестерн-блоттинга.
Юго -западный блоттинг основан на саузерн-блоттинге и используется для идентификации и характеристики ДНК-связывающих белков по их способности связываться со специфическими олигонуклеотидными зондами. [2] Белки разделяются с помощью гель-электрофореза и затем переносятся на нитроцеллюлозные мембраны, как и в других типах блоттинга.
Истерн -блот используется для обнаружения специфических посттрансляционных модификаций белков. Белки разделяются гель-электрофорезом перед переносом на матрицу для блоттинга, после чего посттрансляционные модификации обнаруживаются специфическими субстратами (холерный токсин, конканавалин, фосфомолибдат и т. д.) или антителами. [3]
Дальневосточный блоттинг предназначен для обнаружения липидно-связанных олигосахаридов . Высокоэффективная тонкослойная хроматография сначала используется для разделения липидов по физическим и химическим характеристикам, затем переносится на матрицу блоттинга, прежде чем олигосахариды будут обнаружены специфическим связывающим белком (т. е. антителами или лектинами).
Нозерн -блоттинг предназначен для обнаружения специфических последовательностей РНК в сложных образцах. Нозерн-блоттинг сначала разделяет образцы по размеру с помощью гель-электрофореза, а затем переносит их в матрицу блоттинга и обнаруживает с помощью меченых РНК-зондов.
Обратный нозерн-блоттинг отличается от нозерн- и саузерн-блоттинга тем, что ДНК сначала иммобилизуется на матрице для блоттинга, а специфические последовательности обнаруживаются с помощью меченых РНК-зондов.
Дот -блоттинг — это особый случай любого из вышеперечисленных блотов, при котором аналит добавляется непосредственно в матрицу блоттинга (и отображается в виде «точки»), а не разделяется с помощью электрофореза перед блоттингом.