Семейство тиол-активируемых холестерин-зависимых цитолизинов (CDC) (TC# 1.C.12) является членом суперсемейства MACPF . Холестерин-зависимые цитолизины представляют собой семейство β-цилиндрических порообразующих экзотоксинов , которые секретируются грамположительными бактериями. CDC секретируются в виде водорастворимых мономеров 50-70 кДа, которые при связывании с целевой клеткой образуют кольцевой гомоолигомерный комплекс, содержащий до 40 (или более) мономеров. [1] Благодаря многочисленным конформационным изменениям формируется трансмембранная структура β-цилиндра (~250 Å в диаметре в зависимости от токсина), которая встраивается в мембрану целевой клетки. Для образования пор требуется присутствие холестерина в целевой мембране, хотя присутствие холестерина требуется не всеми CDC для связывания. Например, интермедилизин (ILY; TC# 1.C.12.1.5), секретируемый Streptococcus intermedius, будет связываться только с целевыми мембранами, содержащими специфический белковый рецептор, независимо от присутствия холестерина, но холестерин требуется интермедилизину (ILY; TC# 1.C.12.1.5) для образования пор. Хотя липидная среда холестерина в мембране может влиять на связывание токсина, точный молекулярный механизм, с помощью которого холестерин регулирует цитолитическую активность CDC, до конца не изучен.
Как только пора сформирована в мембране клетки-мишени, регуляция внутриклеточной среды и того, что входит и выходит из клетки, теряется. Пора диаметром ~250 Å достаточно велика, чтобы допустить потерю аминокислот , нуклеотидов , малых и больших белков, а также ионов (Ca2 + , Na + , K + и т. д.). В частности, потеря кальция, который участвует в нескольких молекулярных путях, будет иметь большое влияние на выживаемость клеток. Пора также приведет к притоку воды, что может привести к блеббингу и гибели клетки.
Бактерии тратят энергию на создание этих токсинов, поскольку они действуют как факторы вирулентности . [2] Воздействуя на иммунные клетки, такие как макрофаги, бактерии будут защищены от фагоцитоза и разрушения респираторным взрывом . [3]
На уровне первичной структуры холестеринзависимые цитолизины (CDC) демонстрируют высокую степень сходства последовательностей, варьирующуюся от 40% до 80%. Это в основном отражается в консервативном ядре из примерно 471 аминокислоты, общем для всех CDC, что по сути соответствует последовательности пневмолизина, самого короткого члена семейства. [4] CDC с более длинными последовательностями обычно демонстрируют вариации в N-конце, функции которого неизвестны для многих членов, но для некоторых, как полагают, выполняют различные функции, не связанные с секрецией. Например, листериолизин O (LLO; TC# 1.C.12.1.7) из Listeria monocytogenes демонстрирует богатую пролином последовательность на своем аминоконце , которая играет роль в стабильности LLO. [5] Крайний случай — лектинолизин (LLY; UniProt: B3UZR3) из некоторых штаммов Streptococcus mitis и S. pseudopneumoniae , содержащий функциональный лектин, связывающий фукозу, на аминоконце. [6] [7] Кроме того, все CDC содержат высококонсервативный ундекапептид, который, как полагают, имеет решающее значение для распознавания мембраны, опосредованной холестерином. Мономер CDC состоит из 4 структурных доменов, причем домен 4 (D4) участвует в связывании с мембраной. [8] Несколько мономеров CDC будут олигомеризоваться после связывания с мембраной целевой клетки, образуя структуру β-бочонка, которая будет вставлена в мембрану целевой клетки. Основная часть аминокислот, которая необходима для образования пор, более консервативна между CDC, что иллюстрируется схожими трехмерными структурами [9] и механизмами образования пор. Структурно консервативный домен 4 CDC содержит четыре консервативные петли L1-L3 и ундекапептидную область, которая, как полагают, участвует в зависимом от холестерина распознавании. [10] Модификации отдельных аминокислот в этих петлях предотвратили связывание перфринголизина O (PFO; TC# 1.C.12.1.1), который является CDC, секретируемым Clostridium perfringens, с липосомами , богатыми холестерином . [11] Совсем недавно Фарранд и др. показали, что две аминокислоты, пара треонин-лейцин в петле L1, составляют мотив связывания холестерина и сохраняются во всех известных CDC. [12]
Некоторые кристаллические структуры белка CDC, доступные в RCSB, включают:
Механизм образования пор перфринголизина O (PFO; TC# 1.C.12.1.1), который секретируется Clostridium perfringens , начинается со встречи и связывания с холестерином на целевой мембране. C-конец домена PFO 4 (D4) первым встречает мембрану. Связывание D4 запускает структурную перестройку, при которой мономеры PFO олигомеризуются, образуя комплекс препоры. [2] [13] [14]
Связывание CDC с целевой мембраной необходимо для олигомеризации. [2] Олигомеризация CDC требует преобразования альфа-спиральных областей в амфипатические бета-цепи, что инициируется белок-липидными взаимодействиями или белок-белковыми взаимодействиями. [2] [16] [17] [18] [19] Водорастворимая форма токсинов не может олигомеризоваться, поскольку доступ к одному краю основного β-листа в мономере заблокирован. Если говорить конкретно, β5, короткая полипептидная петля, образует водородные связи с β4, предотвращая взаимодействие β4 с β1 на соседнем мономере. Связывание D4 с поверхностью мембраны вызывает конформационное изменение в домене 3, которое поворачивает β5 от β4, обнажая β4, что позволяет ему взаимодействовать с β1-цепью другой молекулы PFO, инициируя олигомеризацию.
В отличие от большинства открытых поверхностных остатков CDC, которые не сохраняются, остатки на поверхности кончика D4, которые участвуют во взаимодействиях с мембраной, высококонсервативны. [11] Образование пор начинается, когда две амфипатические трансмембранные β-шпильки из ~35 мономеров PFO вставляются согласованным образом, [20] которые затем создают большой β-цилиндр, который перфорирует мембрану. Токсин обходит энергетический барьер вставки CDC в мембрану путем образования β-цилиндра, что снижает энергетические требования по сравнению с тем, что потребовалось бы для вставки отдельных β-шпилек. В водорастворимой мономерной форме CDC трансмембранные β- шпильки , которые расположены по обе стороны от центрального β-листа на домене 3, каждая свернута в три короткие α-спирали, чтобы минимизировать воздействие гидрофобных остатков . [2] α-спирали встраиваются в бислой мембраны клетки-мишени, и происходит конформационное изменение в амфипатические β-шпильки. Необходим согласованный механизм встраивания, чтобы гидрофильные поверхности β-шпилек оставались открытыми для водной среды, а не гидрофобного ядра мембраны.
Шесть коротких α-спиралей в D3 разворачиваются, образуя две трансмембранные β-шпильки (TMH), TMH1 (красная) и TMH2 (зеленая). [8]
Связывание CDC с его целевой мембраной требует распознавания холестерина или, в случае интермедилизина (ILY; TC# 1.C.12.1.5), распознавания человеческого белка CD59, закрепленного на мембране. Распознавание холестерина обеспечивает специфичность для эукариотических клеток, а специфичность для белка CD59, закрепленного на гликозилфосфатидилинозитоле, обеспечивает специфичность для человеческих клеток. Холестерин не требуется для связывания интермедилизина (ILY) с целевой клеткой, поскольку он использует человеческий CD59 для первоначального прикрепления, но присутствие холестерина требуется для образования пор всеми CDC. [21] [22] CDC чувствительны как к кислороду, так и к холестерину. Токсины, выделенные из супернатантов культур , предварительно инкубированных с холестерином, были инактивированы после воздействия кислорода. [23] CDC также чувствительны к pH. Изменение pH в среде с 7,4 до 6,0 вызвало конформационное изменение перфринголизина O, что привело к изменению минимального порога холестерина, необходимого для связывания. [24] Другой CDC, листериолизин O (LLO), который функционирует при кислом pH, потеряет свою функцию при нейтральном pH при температурах выше 30 °C, что вызывает необратимую потерю активности путем развертывания домена 3 в растворимом мономере. [25]
Присутствие холестерина в мембране целевой клетки необходимо для формирования пор CDC. Расположение молекул холестерина в бислое также может быть важным для успешного связывания. Неполярный углеводородный хвост холестерина ориентируется по направлению к гидрофобному центру липидного бислоя мембраны, в то время как группа 3-β-OH ориентирована ближе к эфирным связям, образованным цепями жирных кислот , а глицериновые остовы ближе к поверхности мембраны. Даже при наличии группы 3-β-OH вблизи поверхности мембраны она не очень открыта по сравнению с головками фосфолипидов. Доступность холестерина на поверхности мембраны зависит от его взаимодействия с другими компонентами мембраны, такими как фосфолипиды и белки; и чем больше холестерин взаимодействует с этими компонентами, тем меньше он доступен для взаимодействия с внемембранными молекулами. Некоторые факторы, которые влияют на доступность холестерина, - это размер полярных головок и способность фосфолипида образовывать водородные связи с группой 3-β-OH холестерина. [26] Холестерин связывается с фосфолипидами, образуя стехиометрический комплекс и способствуя текучести мембраны. Если концентрация холестерина превышает определенную точку, свободный холестерин начнет выпадать в осадок из мембраны. [27] Связывание и образование пор CDC произойдет, когда концентрация холестерина превысит ассоциативную способность фосфолипидов, что позволит избыточному холестерину связываться с токсином.
Присутствие агрегатов холестерина в водном растворе было достаточным для инициирования изменения конформации и олигомеризации перфринголизина O (PFO), в то время как никаких изменений не наблюдалось у перфринголизина O с агрегатами эпихолестерина в растворе. [28] Эпихолестерин — это стерол , который отличается от холестерина ориентацией группы 3-β-OH, которая является аксиальной в эпихолестерине и экваториальной в холестерине. Поскольку ориентация гидроксильной группы оказывает такое влияние на связывание/порообразование CDC, экваториальная конформация может потребоваться для стыковки стерола с карманом связывания в домене 4 или для надлежащего экспонирования на поверхности липидных структур.
Консервативный ундекапептидный мотив (ECTGLAWEWWR) в домене 4 CDC является сигнатурным мотивом CDC и первоначально считался мотивом связывания холестерина, но в ряде исследований было показано, что это неверно [10] , и теперь, как описано выше, Фарранд и др. показали, что мотив связывания холестерина представляет собой пару треонина-лейцина в петле 1 у основания домена 4. [12] С тех пор было показано, что консервативный ундекапептид является ключевым элементом в аллостерическом пути, который связывает мембранное связывание с инициацией структурных изменений в домене 3 мономера CDC, что позволяет ему начать процесс олигомеризации в препоровый комплекс. [29]
Состав фосфолипидов клеточной мембраны влияет на расположение холестерина внутри мембраны и способность CDC связываться и инициировать образование пор. Например, перфринголизин O будет преимущественно связываться с богатыми холестерином мембранами, состоящими в основном из фосфолипидов, содержащих 18-углеродные ацильные цепи . [26] Липиды, имеющие коническую молекулярную форму, изменяют энергетическое состояние мембранного холестерина, усиливая взаимодействие стерола с холестерин-специфическим цитолизином . [30] Поскольку для связывания CDC/образования пор требуются высокие концентрации холестерина, считалось, что CDC будет ассоциироваться с липидными плотами . Более позднее исследование показало, что сфингомиелин , необходимый компонент образования липидных плотов, скорее ингибировал, чем способствовал связыванию перфринголизина O с целевой мембраной. [31]
Возможно, что воздействие холестерина на поверхность мембраны может быть облегчено другими секретируемыми токсинами, повреждающими мембрану, такими как фосфолипаза C , которая расщепляет головные группы фосфолипидов, увеличивая воздействие холестерина. Два организма, Clostridium perfringens , который производит перфринголизин O (CDC) и α-токсин во время клостридиального мионекроза [32] и Listeria monocytogenes , который высвобождает листериолизин O (CDC) и фосфолипазы C, что приводит к вирулентности этих бактерий. [33] Однако, хотя обработка липосомальных мембран α-токсином C. perfringens увеличивает активность PFO на этих мембранах, этот эффект, по-видимому, не всегда имеет место «in vivo». При газовой гангрене (мионекрозе) C. perfringens основным местом действия α-токсина C. perfringens является мышечная ткань, где расщепление фосфолипидных головных групп, по-видимому, не увеличивает активность перфринголизина O в этой ткани, поскольку нокауты PFO, по-видимому, не оказывают существенного влияния на течение мионекроза. [32] Таким образом, расщепление головных групп в мышечной ткани α-токсином, по-видимому, не приводит к значительному увеличению активности PFO в этой ткани.