.jpg/1280px-Atlantic_horseshoe_crab_(Limulus_polyphemus).jpg)
Коагулин — это гелеобразующий белок гемолимфы , который препятствует распространению бактериальных и грибковых захватчиков, обездвиживая их. Он вырабатывается в форме коагулогена, а затем расщепляется в активную форму через каскад сериновых протеиназ. [1] [2] [3] Он был наиболее подробно изучен у мечехвостов . Он также вырабатывался другими организмами, такими как Bacillus coagulans I 4, в плазмидной локализации. [4] В медицине коагуляция коагулина является основой обнаружения бактериального эндотоксина с помощью теста на лизат амебоцитов Limulus для парентеральных препаратов.
Коагулоген содержит одну полипептидную цепь из 175 остатков, которая расщепляется после Arg-18 и Arg-46 ферментом свертывания Limulus, содержащимся в гранулярных гемоцитарных клетках гемолимфы. Инициируется путь, в котором в конечном итоге фермент свертывания Limulus расщепляет коагулоген до коагулина. Расщепление высвобождает две цепи коагулина, цепи A и B, ковалентно связанные двумя дисульфидными связями , вместе с пептидом C. [1] [2] [5] Складка AB оборачивается вокруг спирального пептида C, образуя компактную структуру. [6] Приблизительная масса коагулина составляет 3-4 кДа по данным SDS-PAGE. [4] Образование геля происходит в результате связывания молекул коагулина. [1] Перед связыванием мономеров коагулина пептид C отщепляется от коагулогена. Удаление пептида C обнажает расширенную гидрофобную полосу вновь расщепленной молекулы, что позволяет взаимодействовать с гидрофобным краем второй молекулы. [6] [7] Известна полная структура коагулогена ( PDB : 1AOC ); он разделяет то же суперсемейство цитокинов с цистиновым узлом (складку), что и нейротрофины , с несколькими сохраненными цистеинами.
Коагуляция гемолимфы является частью иммунного ответа беспозвоночных. Факторы внутри гемолимфы активируются и инициируют путь, по которому образуются нерастворимые сгустки, чтобы предотвратить утечку телесных жидкостей и инфицирование организма иммобилизованными микробами. [8] Это имеет решающее значение, поскольку беспозвоночные организмы не имеют адаптивной иммунной системы, сопоставимой с иммунной системой млекопитающих. [7] У ракообразных коагуляция гемолимфы зависит от опосредованного трансглутаминазой перекрестного связывания специфических белков свертывания плазмы, но без протеолитического каскада. [9]
У мечехвостов каскад протеолитической коагуляции запускается липополисахаридами и бета-1,3-глюканами . В гемолимфе мечехвостов есть два типа гемоцитов: гранулярные и негранулярные. Гранулярные гемоциты активируются бактериальными эндотоксинами липополисахаридами (ЛПС), которые находятся на поверхности грамотрицательных бактерий. «... ЛПС составляют приблизительно 70% внешних мембран грамотрицательных бактерий». [10] Они также активируются бета-1,3-глюканами, которые находятся на клеточных стенках дрожжей и некоторых грибов. [5] [7]
В пути, активируемом ЛПС, ЛПС активирует зимогенный фактор C. Он автокаталитически превращается в активированную форму фактора C. Активный фактор C преобразует неактивный фактор B в активный фактор B. Активный фактор B преобразует прокоагулирующий фермент в коагулирующий фермент . [5] Коагулирующий фермент расщепляет коагулоген на коагулины , в результате чего образуются нековалентные гомополимеры коагулинов посредством взаимодействия голова к хвосту.
В пути, активированном бета-1,3-глюканом, есть небольшие различия. Бета-1,3-глюкан активирует зимогенный фактор G. Он автокаталитически превращается в активированный формфактор G. Отсюда путь сходится в путь, активированный ЛПС. Активный фактор G преобразует прокоагуляционный фермент в коагуляционный фермент для расщепления коагулогена в коагулин . [5] В обоих путях образование геля происходит, когда конечный фермент трансглутаминаза сшивает коагулин. [7]
Однако трансглютаминаза мечехвоста не сшивает коагулины межмолекулярно. Недавно было обнаружено, что коагулины сшиваются на поверхностных белках гемоцитов, называемых проксинами. Это указывает на то, что реакция сшивания на заключительном этапе коагуляции гемолимфы является важной врожденной иммунной системой мечехвостов. [9]
Для сравнения, свертывание крови млекопитающих отличается от свертывания гемолимфы. Свертывание крови млекопитающих в значительной степени зависит от тромбоцитов и фибрина, тогда как гемолимфа не содержит тромбоцитов или фибрина, а содержит гемоциты. [ требуется ссылка ] Свертывание крови млекопитающих основано на протеолитически индуцированной полимеризации фибриногенов . Существует два пути (тканевой фактор и контакт), которые приводят к тому, что тромбин превращает фибриноген в фибрин. Мономеры фибрина нековалентно взаимодействуют друг с другом и полимеризуются, образуя сгусток крови. [11] Фибрин и коагулин аналогичны друг другу. Сходства между свертыванием крови млекопитающих и свертыванием гемолимфы включают образование геля, ТГазу и служат частью заживления ран. [7] Однако сгусток, образующийся при свертывании гемолимфы, мягче, чем сгусток фибрина млекопитающих. [5] [7]
Лизат амебоцитов Limulus встречается только у мечехвостов, в частности у вида Limulus polyphemus . В присутствии бактериальных эндотоксинов (ЛПС) и бета-1,3-глюканов он инициирует пути коагуляции. Он используется как одобренный FDA метод анализа для проверки стерильности медицинских инструментов и инъекционных препаратов, например, в фармацевтической промышленности. [12]
С 1970-х годов тест на лизат амебоцитов Limulus использовался для проверки образцов крови человека на наличие эндотоксинов. Первоначальный метод ( тест на гелеобразование Limulus ) включал качественный поиск образования коагуляционного геля. После одного часа инкубации, если образец коагулировался, он образовывал твердый сгусток, который был положительным на эндотоксины. Если образец не коагулировался, он был жидким и был отрицательным на эндотоксины. [10] Однако этот метод был ограничен своей чувствительностью. [13]
Сегодня тест Limulus в сто раз более чувствителен и использует хромогенный метод обнаружения. [5] Когда коагулоген расщепляется ферментом свертывания, образуется коагулин . Однако фермент свертывания также производит хромогенный конечный продукт, известный как pNA. pNA (Boc-Leu-Gly-Arg-p-нитроанилид) является хромогенным продуктом, который испускает желтый цвет. [14] [15] Концентрацию эндотоксинов в образце можно рассчитать, измерив поглощение высвобожденного pNA при 405 нм. [5] [15]
Коагулин обнаружен у четырех видов мечехвостов: Limulus polyphemus , Tachypleus tridentatus , Tachypleus gigas и Carcinoscorpius rotundicauda . Они считаются «живыми ископаемыми», поскольку существуют уже 445–500 миллионов лет и практически не изменились по сравнению со своими предками. [7] [12] Предшественник коагулина, коагулоген, имеет частоту мутаций 1,2 x 10−9 на аминокислоту в год по сравнению с его аналогом у млекопитающих, фибриногеном, с частотой мутаций 8,3 x 10−9 . [ 7] Он содержится в гемоцитах, типе фагоцитов . Существуют различные типы фагоцитов, и они встречаются во всех группах беспозвоночных (как гемоциты, амебоциты или целомоциты). Сравнивая позвонки и системы коагуляции Limulus polyphemus , ни один из каскадных белков (включая коагулоген) не имеет общего домена белка, за исключением двух: гемолектина и ТГазы. Хотя эти две системы функционально схожи, белки коагуляции «имеют разную эволюционную историю». [16]