Флуоресцентный микроскоп — это оптический микроскоп , который использует флуоресценцию вместо или в дополнение к рассеянию , отражению , затуханию или поглощению для изучения свойств органических или неорганических веществ. [1] [2] «Флуоресцентный микроскоп» относится к любому микроскопу, который использует флуоресценцию для создания изображения, будь то простая установка, такая как эпифлуоресцентный микроскоп, или более сложная конструкция, такая как конфокальный микроскоп , в котором для получения изображений используются оптические срезы . лучшее разрешение флуоресцентного изображения. [3]
Образец освещается светом определенной длины волны (или длин волн), который поглощается флуорофорами , заставляя их излучать свет с более длинными волнами (т. е. другого цвета, чем поглощаемый свет). Свет освещения отделяется от гораздо более слабой излучаемой флуоресценции с помощью спектрального фильтра излучения. Типичными компонентами флуоресцентного микроскопа являются источник света ( распространены ксеноновая дуговая лампа или ртутная лампа ; более совершенные формы — мощные светодиоды и лазеры ), фильтр возбуждения , дихроичное зеркало (или дихроичный светоделитель ) и излучатель. фильтр (см. рисунок ниже). Фильтры и дихроичный светоделитель выбираются в соответствии со спектральными характеристиками возбуждения и излучения флуорофора, используемого для маркировки образца. [1] Таким образом, одновременно визуализируется распределение одного флуорофора (цвета). Многоцветные изображения нескольких типов флуорофоров необходимо составлять путем объединения нескольких одноцветных изображений. [1]
Большинство используемых флуоресцентных микроскопов являются эпифлуоресцентными микроскопами, в которых возбуждение флуорофора и обнаружение флуоресценции осуществляются через один и тот же путь света (т.е. через объектив). Эти микроскопы широко используются в биологии и являются основой для более совершенных конструкций микроскопов, таких как конфокальный микроскоп и флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения (TIRF).
Большинство флуоресцентных микроскопов, особенно тех, которые используются в науках о жизни , имеют эпифлуоресцентную конструкцию, показанную на схеме. Свет с длиной волны возбуждения освещает образец через объектив . Флуоресценция , излучаемая образцом, фокусируется на детекторе с помощью того же объектива, который используется для возбуждения; для большего разрешения потребуется объектив с более высокой числовой апертурой . Поскольку большая часть возбуждающего света проходит через образец, только отраженный возбуждающий свет достигает объектива вместе с испускаемым светом, и поэтому метод эпифлуоресценции обеспечивает высокое соотношение сигнал/шум. Дихроичный светоделитель действует как фильтр с определенной длиной волны, пропуская флуоресцентный свет к окуляру или детектору, но отражая любой оставшийся возбуждающий свет обратно к источнику.
Флуоресцентная микроскопия требует интенсивного, почти монохроматического освещения, которое не могут обеспечить некоторые широко распространенные источники света, такие как галогенные лампы . [4] Используются четыре основных типа источников света, включая ксеноновые дуговые лампы или ртутные лампы с фильтром возбуждения , лазеры , источники суперконтинуума и мощные светодиоды . Лазеры наиболее широко используются для более сложных методов флуоресцентной микроскопии, таких как конфокальная микроскопия и флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения , в то время как ксеноновые лампы, ртутные лампы и светодиоды с дихроичным фильтром возбуждения обычно используются для широкопольных эпифлуоресцентных микроскопов. Поместив две матрицы микролинз на путь освещения широкопольного эпифлуоресцентного микроскопа, можно достичь высокой однородности освещения с коэффициентом вариации 1-2%.
Чтобы образец был пригоден для флуоресцентной микроскопии, он должен быть флуоресцентным. Существует несколько методов создания флуоресцентного образца; Основными методами являются маркировка флуоресцентными красителями или, в случае биологических образцов, экспрессия флуоресцентного белка . Альтернативно можно использовать собственную флуоресценцию образца (т.е. автофлуоресценцию ). [1] В науках о жизни флуоресцентная микроскопия является мощным инструментом, который позволяет проводить специфическое и чувствительное окрашивание образца с целью обнаружения распределения белков или других представляющих интерес молекул. В результате существует широкий спектр методов флуоресцентного окрашивания биологических образцов.
Многие флуоресцентные красители были разработаны для целого ряда биологических молекул. Некоторые из них представляют собой небольшие молекулы, которые по своей природе флуоресцентны и связывают интересующую биологическую молекулу. Основными примерами являются пятна нуклеиновых кислот , такие как DAPI и Hoechst (возбуждаемые ультрафиолетовым светом), а также DRAQ5 и DRAQ7 (оптимально возбуждаемые красным светом), которые связывают малую бороздку ДНК , маркируя таким образом ядра клеток. Другие представляют собой лекарства, токсины или пептиды, которые связывают определенные клеточные структуры и были получены с помощью флуоресцентного репортера. Основным примером этого класса флуоресцентных красителей является фаллоидин , который используется для окрашивания актиновых волокон в клетках млекопитающих . Новый пептид, известный как гибридизирующий пептид коллагена , также можно конъюгировать с флуорофорами и использовать для окрашивания денатурированных коллагеновых волокон. Окрашивание стенок растительных клеток производят красителями или красителями, связывающими целлюлозу или пектин . Поиск флуоресцентных зондов с высокой специфичностью, которые также позволяют получать живые изображения растительных клеток, продолжается. [7]
Существует множество флуоресцентных молекул, называемых флуорофорами или флуорохромами, таких как флуоресцеин , Alexa Fluors или DyLight 488 , которые могут быть химически связаны с другой молекулой, которая связывает интересующую мишень в образце.
Иммунофлуоресценция — это метод, который использует высокоспецифическое связывание антитела с его антигеном для маркировки определенных белков или других молекул внутри клетки. Образец обрабатывают первичным антителом, специфичным к интересующей молекуле. Флуорофор можно напрямую конъюгировать с первичным антителом. Альтернативно можно использовать вторичное антитело , конъюгированное с флуорофором, которое специфически связывается с первым антителом. Например, первичное антитело, полученное у мыши, которое распознает тубулин, в сочетании со вторичным антимышиным антителом, полученным с помощью флуорофора, можно использовать для мечения микротрубочек в клетке.
Современное понимание генетики и методы, доступные для модификации ДНК, позволяют ученым генетически модифицировать белки, чтобы они также содержали флуоресцентный белок-репортер. В биологических образцах это позволяет ученым напрямую сделать интересующий белок флуоресцентным. Затем местоположение белка можно будет напрямую отслеживать, в том числе в живых клетках.
Флуорофоры теряют способность флуоресцировать при освещении в процессе, называемом фотообесцвечиванием . Фотообесцвечивание происходит, когда флуоресцентные молекулы накапливают химические повреждения от электронов, возбужденных во время флуоресценции. Фотообесцвечивание может существенно ограничить время, в течение которого образец можно наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии. Существует несколько методов уменьшения фотообесцвечивания, таких как использование более надежных флуорофоров, минимизация освещения или использование фотозащитных химикатов- поглотителей .
Флуоресцентная микроскопия с флуоресцентными репортерными белками позволила анализировать живые клетки с помощью флуоресцентной микроскопии, однако клетки чувствительны к фототоксичности, особенно коротковолновому свету. Кроме того, флуоресцентные молекулы имеют тенденцию генерировать химически активные соединения при освещении, что усиливает фототоксический эффект.
В отличие от методов микроскопии в проходящем и отраженном свете, флуоресцентная микроскопия позволяет наблюдать только определенные структуры, помеченные для флуоресценции. Например, наблюдение образца ткани, приготовленного с помощью флуоресцентного окрашивания ДНК, с помощью флуоресцентной микроскопии выявляет только организацию ДНК внутри клеток и ничего больше не говорит о морфологии клеток.
Вычислительные методы, которые предлагают оценивать флуоресцентный сигнал по нефлуоресцентным изображениям (например, светлому полю), могут уменьшить эти проблемы. [8] Как правило, эти подходы включают в себя обучение глубокой сверточной нейронной сети на окрашенных клетках и последующую оценку флуоресценции на неокрашенных образцах. Таким образом, отделив исследуемые клетки от клеток, используемых для обучения сети, визуализацию можно выполнять быстрее и с меньшей фототоксичностью.
Волновая природа света ограничивает размер пятна, в которое может быть сфокусирован свет, из-за дифракционного предела . Это ограничение было описано в 19 веке Эрнстом Аббе и «ограничивает разрешение оптического микроскопа примерно половиной длины волны используемого света». Флуоресцентная микроскопия занимает центральное место во многих методах, целью которых является преодоление этого предела с помощью специализированных оптических конфигураций.
В 20 веке было изобретено несколько усовершенствований в методах микроскопии, которые в некоторой степени привели к увеличению разрешения и контрастности. Однако они не преодолели дифракционный предел. В 1978 году были разработаны первые теоретические идеи, позволяющие преодолеть этот барьер путем использования микроскопа 4Pi в качестве конфокального лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа, в котором свет идеально фокусируется со всех сторон в общий фокус, который используется для сканирования объекта «поточечно». «точечное» возбуждение в сочетании с «поточечным» обнаружением. [9] Однако первая экспериментальная демонстрация микроскопа 4pi состоялась в 1994 году. [10] Микроскопия 4Pi максимизирует количество доступных направлений фокусировки за счет использования двух противоположных объективов или микроскопии с двухфотонным возбуждением с использованием красного смещения света и многофотонного возбуждения. .
Интегрированная корреляционная микроскопия сочетает в себе флуоресцентный и электронный микроскоп. Это позволяет визуализировать ультраструктуру и контекстную информацию с помощью электронного микроскопа, используя данные флуоресцентного микроскопа в качестве инструмента маркировки. [11]
Первым методом, действительно достигшим субдифракционного разрешения, была STED-микроскопия , предложенная в 1994 году. Этот метод и все методы, следующие за концепцией RESOLFT , основаны на сильном нелинейном взаимодействии между светом и флуоресцирующими молекулами. Молекулы сильно перемещаются между различимыми молекулярными состояниями в каждом конкретном месте, так что, в конечном итоге, свет может излучаться только в небольшой части пространства, что приводит к увеличению разрешения.
Также в 1990-е годы был разработан еще один метод микроскопии сверхвысокого разрешения, основанный на широкопольной микроскопии. Существенно улучшенное размерное разрешение клеточных наноструктур , окрашенных флуоресцентным маркером, было достигнуто за счет развития локализационной СПДМ-микроскопии и структурированного лазерного освещения (пространственно-модулированное освещение, SMI). [12] Сочетание принципа SPDM с SMI привело к разработке микроскопа Vertico SMI . [13] [14] Обнаружение отдельных молекул нормальных мигающих флуоресцентных красителей, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP), может быть достигнуто с помощью дальнейшего развития SPDM, так называемой технологии SPDMphymod, которая позволяет обнаруживать и подсчитывать два разных типа флуоресцентных молекул. на молекулярном уровне (эта технология называется двухцветной локализационной микроскопией или 2CLM). [15]
Альтернативно, появление фотоактивируемой локализационной микроскопии могло бы достичь аналогичных результатов, полагаясь на мигание или переключение отдельных молекул, где доля флуоресцирующих молекул в каждый момент времени очень мала. Эта стохастическая реакция молекул на приложенный свет также соответствует сильно нелинейному взаимодействию, приводящему к субдифракционному разрешению.
Материал был скопирован из этого источника, который доступен по международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0.
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )