stringtranslate.com

STED-микроскопия

Микроскопия с истощением стимулированного излучения (STED) обеспечивает значительное улучшение разрешения по сравнению с возможным при конфокальной микроскопии .

Микроскопия с истощением стимулированного излучения ( STED ) является одним из методов, составляющих микроскопию сверхвысокого разрешения . Она создает изображения сверхвысокого разрешения путем селективной дезактивации флуорофоров , минимизируя область освещения в фокальной точке и, таким образом, увеличивая достижимое разрешение для данной системы. [1] Она была разработана Стефаном В. Хеллом и Яном Вихманном в 1994 году [2] и впервые экспериментально продемонстрирована Хеллом и Томасом Кларом в 1999 году. [3] Хелл был удостоен Нобелевской премии по химии в 2014 году за свою разработку. В 1986 году В. А. Охонин [4] (Институт биофизики СО АН СССР, Красноярск) запатентовал идею STED. [5] Этот патент был неизвестен Хеллу и Вихманну в 1994 году.

Микроскопия STED — один из нескольких типов методов микроскопии сверхвысокого разрешения , которые были недавно разработаны для обхода дифракционного предела световой микроскопии с целью повышения разрешения. STED — это детерминированный функциональный метод, который использует нелинейный отклик флуорофоров, обычно используемых для маркировки биологических образцов, для достижения улучшения разрешения, то есть STED позволяет получать изображения с разрешением ниже дифракционного предела. Это отличается от стохастических функциональных методов, таких как фотоактивируемая локализационная микроскопия (PALM) и стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (STORM), поскольку эти методы используют математические модели для реконструкции субдифракционного предела из множества наборов изображений с дифракционным ограничением.

Фон

Формула Эрнста Аббе для дифракционного предела, высеченная на камне на памятнике в Йене .
Диаграмма Яблонского, показывающая красное смещение стимулированного фотона. Это красное смещение позволяет игнорировать стимулированный фотон.
Схема конструкции устройства STED. Двойная конструкция лазера позволяет использовать возбуждение и вынужденное излучение совместно для STED.

В традиционной микроскопии разрешение, которое может быть получено, ограничено дифракцией света . Эрнст Аббе разработал уравнение для описания этого предела. Уравнение выглядит так:

где D — дифракционный предел, λ — длина волны света, а NA — числовая апертура или показатель преломления среды, умноженный на синус угла падения. n описывает показатель преломления образца, α измеряет телесный полуугол, из которого свет собирается объективом, λ — длина волны света, используемого для возбуждения образца, а NA — числовая апертура. Для получения высокого разрешения (т. е. малых значений d) оптимальными являются короткие длины волн и высокие значения NA (NA = n sinα). [6] Этот дифракционный предел является стандартом, по которому измеряются все методы сверхразрешения. Поскольку STED селективно дезактивирует флуоресценцию, он может достигать разрешения лучше, чем традиционная конфокальная микроскопия. Нормальная флуоресценция происходит путем возбуждения электрона из основного состояния в возбужденное электронное состояние другого фундаментального энергетического уровня (S0 переходит в S1), который после релаксации обратно в основное состояние (из S1) испускает фотон, опускаясь с S1 на колебательный энергетический уровень на S0. STED прерывает этот процесс до того, как фотон высвобождается. Возбужденный электрон вынужден релаксировать в более высокое колебательное состояние, чем переход флуоресценции, в результате чего высвобождаемый фотон смещается в красную область, как показано на изображении справа. [7] Поскольку электрон переходит в более высокое колебательное состояние, разница в энергии двух состояний ниже, чем разница в нормальной флуоресценции. Это снижение энергии увеличивает длину волны и заставляет фотон смещаться дальше в красную часть спектра. Этот сдвиг различает два типа фотонов и позволяет игнорировать стимулированный фотон.

Чтобы вызвать эту альтернативную эмиссию, падающий фотон должен ударить по флуорофору. Эта необходимость быть ударенным падающим фотоном имеет два последствия для STED. Во-первых, количество падающих фотонов напрямую влияет на эффективность этой эмиссии, и, во-вторых, при достаточно большом количестве фотонов флуоресценция может быть полностью подавлена. [8] Чтобы достичь большого количества падающих фотонов, необходимых для подавления флуоресценции, лазер, используемый для генерации фотонов, должен иметь высокую интенсивность. К сожалению, этот лазер высокой интенсивности может привести к проблеме фотообесцвечивания флуорофора. Фотообесцвечивание — это название разрушения флуорофоров светом высокой интенсивности.

Процесс

Сравнение конфокальной микроскопии и STED-микроскопии. Это показывает улучшенное разрешение STED-микроскопии по сравнению с традиционными методами.
Пятно возбуждения (2D, слева), пятно девозбуждения в форме пончика (в центре) и оставшаяся область, допускающая флуоресценцию (справа).

STED функционирует, истощая флуоресценцию в определенных областях образца, оставляя центральное фокусное пятно активным для испускания флуоресценции. Эта фокусная область может быть спроектирована путем изменения свойств плоскости зрачка объективной линзы. [9] [10] [11] Наиболее распространенным ранним примером этих дифракционных оптических элементов, или ДОЭ, является форма тора , используемая в двумерном боковом ограничении, показанном ниже. Красная зона истощается, в то время как зеленое пятно остается активным. Этот ДОЭ генерируется круговой поляризацией лазера истощения в сочетании с оптическим вихрем . Боковое разрешение этого ДОЭ обычно составляет от 30 до 80 нм. Однако сообщалось о значениях до 2,4 нм. [12] Используя различные ДОЭ, было продемонстрировано осевое разрешение порядка 100 нм. [13] Модифицированное уравнение Аббе описывает это субдифракционное разрешение следующим образом:

Где - показатель преломления среды, - внутрирезонаторная интенсивность, - интенсивность насыщения . Где - фактор насыщения, выражающий отношение приложенной (максимальной) интенсивности STED к интенсивности насыщения, . [6] [14]

Для оптимизации эффективности STED деструктивная интерференция в центре фокусного пятна должна быть максимально близка к идеальной. Это накладывает определенные ограничения на оптику, которую можно использовать.

Красители

На ранних этапах разработки STED количество красителей, которые можно было использовать в этом процессе, было весьма ограничено. Родамин B был назван в первом теоретическом описании STED. [2] В результате первыми красителями, которые использовались, были лазеры, излучающие в красном спектре. Чтобы обеспечить анализ биологических систем с помощью STED, красители и лазерные источники должны быть адаптированы к системе. Это стремление к лучшему анализу этих систем привело к появлению STED для живых клеток и многоцветного STED, но оно также потребовало все более и более совершенных красителей и систем возбуждения для обеспечения возросшей функциональности. [7]

Одним из таких достижений стала разработка иммуномеченых клеток. Эти клетки представляют собой флуоресцентные красители STED, связанные с антителами через амидные связи. Первое использование этой техники сочетало MR-121SE, красный краситель, со вторичным антимышиным антителом. [8] С того первого применения эта техника применялась к гораздо более широкому спектру красителей, включая зеленый, Atto 532, [15] [16] [17] и желтый, Atto 590, [18] , а также дополнительные красные красители. Кроме того, Atto 647N был впервые использован с этим методом для получения двухцветного STED. [19]

Приложения

За последние несколько лет STED превратился из сложной и высокоспецифичной техники в общий метод флуоресценции. В результате был разработан ряд методов, расширяющих полезность STED и позволяющих предоставлять больше информации.

Структурный анализ

С самого начала процесса STED позволил флуоресцентной микроскопии выполнять задачи, которые были возможны только с использованием электронной микроскопии. Например, STED использовался для выяснения анализа структуры белка на уровне суборганелл. Распространенным доказательством этого уровня исследования является наблюдение за филаментами цитоскелета. Кроме того, нейрофиламенты , актин и тубулин часто используются для сравнения разрешающей способности STED и конфокальных микроскопов. [20] [21] [22]

Используя STED, было достигнуто латеральное разрешение 70–90 нм при изучении SNAP25 , человеческого белка, регулирующего слияние мембран. Это наблюдение показало, что SNAP25 образует кластеры независимо от функциональности мотива SNARE и связывается с кластерным синтаксином. [23] [24] Исследования сложных органелл, таких как митохондрии, также извлекают пользу из микроскопии STED для структурного анализа. Используя изготовленные на заказ микроскопы STED с латеральным разрешением менее 50 нм, было обнаружено, что митохондриальные белки Tom20 , VDAC1 и COX2 распределяются в виде наномасштабных кластеров. [25 ] [26] Другое исследование использовало самодельную микроскопию STED и флуоресцентный краситель для связывания ДНК , измерив длины фрагментов ДНК гораздо точнее, чем обычное измерение с помощью конфокальной микроскопии . [27]

Коррелятивные методы

Благодаря своей функции STED-микроскопия часто может использоваться с другими методами высокого разрешения. Разрешение как электронной, так и атомно-силовой микроскопии даже лучше, чем разрешение STED, но, объединив атомную силу с STED, Шима и др. смогли визуализировать актиновый цитоскелет клеток рака яичников человека , наблюдая при этом изменения жесткости клеток. [28]

Многоцветный

Многоцветный STED был разработан в ответ на растущую проблему использования STED для изучения зависимости между структурой и функцией в белках. Для изучения этого типа сложной системы необходимо использовать по крайней мере два отдельных флуорофора. Используя два флуоресцентных красителя и пары пучков, возможна колокализованная визуализация синаптических и митохондриальных белковых кластеров с разрешением до 5 нм [18]. Многоцветный STED также использовался для того, чтобы показать, что различные популяции белков синаптических везикул не смешивают синаптические бутоны побега. [29] [30] При использовании двухцветного STED с многожизненной визуализацией возможна трехканальная STED.

Живая клетка

Раньше считалось, что STED является полезным методом для работы с живыми клетками. [13] К сожалению, единственным способом изучения клеток было маркирование плазматической мембраны органическими красителями. [29] Сочетание STED с флуоресцентной корреляционной спектроскопией показало, что молекулярные комплексы, опосредованные холестерином, улавливают сфинголипиды , но только временно. [31] Однако только флуоресцентные белки обеспечивают возможность визуализации любой органеллы или белка в живой клетке. Было показано, что этот метод работает с латеральным разрешением 50 нм в клетках млекопитающих, экспрессирующих цитрин-тубулин. [32] [33] Помимо обнаружения структур в клетках млекопитающих, STED позволил визуализировать кластеризацию PIN-белков, помеченных YFP, в плазматической мембране растительных клеток. [34]

Недавно была проведена многоцветная STED-диагностика живых клеток с использованием импульсного дальнего красного лазера и экспрессии CLIPf-tag и SNAPf-tag. [35]

В мозге интактных животных

Поверхностные слои коры головного мозга мыши можно многократно визуализировать через краниальное окно. [36] Это позволяет отслеживать судьбу и форму отдельных дендритных шипиков в течение многих недель. [37] С помощью двухцветного STED можно даже разрешить наноструктуру постсинаптической плотности у живых животных. [38]

STED по видео тарифам и выше

Суперразрешение требует небольших пикселей, что означает больше пространства для получения в данном образце, что приводит к более длительному времени получения. Однако размер фокусного пятна зависит от интенсивности лазера, используемого для истощения. В результате этот размер пятна можно настроить, изменив размер и скорость визуализации. Затем можно достичь компромисса между этими двумя факторами для каждой конкретной задачи визуализации. Были зарегистрированы скорости 80 кадров в секунду с фокусными пятнами около 60 нм. [1] [39] Для небольших полей зрения можно достичь до 200 кадров в секунду. [40]

Проблемы

Фотообесцвечивание может происходить либо от возбуждения в еще более высокое возбужденное состояние, либо от возбуждения в триплетном состоянии. Чтобы предотвратить возбуждение возбужденного электрона в другое, более высокое возбужденное состояние, энергия фотона, необходимая для запуска альтернативной эмиссии, не должна перекрывать энергию возбуждения из одного возбужденного состояния в другое. [41] Это гарантирует, что каждый лазерный фотон, который контактирует с флуорофорами, вызовет стимулированное излучение, а не заставит электрон возбудиться в другое, более высокое энергетическое состояние. Триплетные состояния живут гораздо дольше, чем синглетные, и чтобы предотвратить возбуждение триплетных состояний, время между лазерными импульсами должно быть достаточно большим, чтобы позволить электрону расслабиться с помощью другого метода гашения, или следует добавить химическое соединение для гашения триплетного состояния. [20] [42] [43]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ ab Westphal, V.; SO Rizzoli; MA Lauterbach; D. Kamin; R. Jahn; SW Hell (2008). «Оптическая наноскопия с видеочастотой в дальнем поле анализирует движение синаптических везикул». Science . 320 (5873): 246–249. Bibcode :2008Sci...320..246W. doi : 10.1126/science.1154228 . PMID  18292304. S2CID  14169050.
  2. ^ ab Hell, SW; Wichmann, J. (1994). «Преодоление предела разрешения дифракции с помощью стимулированной эмиссии: флуоресцентная микроскопия с истощением стимулированной эмиссии». Optics Letters . 19 (11): 780–782. Bibcode : 1994OptL...19..780H. doi : 10.1364/OL.19.000780. PMID  19844443.
  3. ^ Klar, Thomas A.; Stefan W. Hell (1999). «Разрешение субдифракции в дальнепольной флуоресцентной микроскопии». Optics Letters . 24 (14): 954–956. Bibcode : 1999OptL...24..954K. doi : 10.1364/OL.24.000954. PMID  18073907.
  4. ^ "Виктор Охонин".
  5. ^ Охонин ВА , Метод исследования микроструктуры образца, Патент SU 1374922, (См. также в базе данных патентов СССР SU 1374922) дата приоритета 10 апреля 1986 г., Опубликовано 30 июля 1991 г., Рефераты советских патентов, Раздел EI, Неделя 9218, Derwent Publications Ltd., Лондон, Великобритания; Класс S03, стр. 4. Ссылаются на патенты US 5394268 A (1993) и US RE38307 E1 (1995). Из английского перевода: "Сущность изобретения заключается в следующем. Люминесценция возбуждается в образце, помещенном в поле нескольких стоячих световых волн, которые вызывают гашение люминесценции из-за стимулированных переходов...".
  6. ^ ab Blom, H.; Brismar, H. (2014). «STED-микроскопия: повышенное разрешение для медицинских исследований?». Journal of Internal Medicine . 276 (6): 560–578. doi : 10.1111/joim.12278 . PMID  24980774.
  7. ^ ab Мюллер, Т.; Шуман, К.; Крэгелох, А. (2012). «STED-микроскопия и ее применение: новые знания о клеточных процессах в наномасштабе». ChemPhysChem . 13 (8): 1986–2000. doi :10.1002/cphc.201100986. PMID  22374829.
  8. ^ ab Dyba, M.; Hell, SW (2003). "Фотостабильность флуоресцентного маркера при импульсном истощении возбужденного состояния посредством стимулированного излучения". Applied Optics . 42 (25): 5123–5129. Bibcode :2003ApOpt..42.5123D. doi :10.1364/AO.42.005123. PMID  12962391.
  9. ^ Török, P.; Munro, PRT (2004). «Использование векторных пучков Гаусса-Лагерра в STED-микроскопии». Optics Express . 12 (15): 3605–3617. Bibcode : 2004OExpr..12.3605T. doi : 10.1364/OPEX.12.003605 . PMID  19483892.
  10. ^ Келлер, Дж.; Шёнле, А.; Хелл, С.В. (2007). «Эффективные шаблоны ингибирования флуоресценции для микроскопии RESOLFT». Optics Express . 15 (6): 3361–3371. Bibcode : 2007OExpr..15.3361K. doi : 10.1364/OE.15.003361 . PMID  19532577. S2CID  31855914.
  11. ^ SW Hell, Reuss, M (январь 2010 г.). «Двулучепреломляющее устройство превращает стандартный сканирующий микроскоп в STED-микроскоп, который также отображает молекулярную ориентацию». Optics Express . 18 (2): 1049–58. Bibcode : 2010OExpr..18.1049R. doi : 10.1364/OE.18.001049 . PMID  20173926.{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  12. ^ Wildanger, D.; BR Patton; H. Schill; L. Marseglia; JP Hadden; S. Knauer; A. Schönle; JG Rarity; JL O'Brien; SW Hell; JM Smith (2012). «Твердое погружение облегчает флуоресцентную микроскопию с нанометровым разрешением и локализацией излучателя в диапазоне субангстремов». Advanced Materials . 24 (44): OP309–OP313. Bibcode :2012AdM....24P.309W. doi :10.1002/adma.201203033. PMC 3546393 . PMID  22968917. 
  13. ^ ab Klar, TA; S. Jakobs; M. Dyba; A. Egner; SW Hell (2000). "Флуоресцентная микроскопия с барьером разрешения дифракции, преодоленным стимулированным излучением". Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 97 (15): 8206–8210. Bibcode :2000PNAS...97.8206K. doi : 10.1073/pnas.97.15.8206 . PMC 26924 . PMID  10899992. 
  14. ^ Hell, Stefan W. (ноябрь 2003 г.). «К флуоресцентной наноскопии». Nature Biotechnology . 21 (11): 1347–1355. doi :10.1038/nbt895. ISSN  1546-1696. PMID  14595362. S2CID  25695312.
  15. ^ Лэнг, Зибер (апрель 2006 г.). «Мотив SNARE необходим для формирования кластеров синтаксина в плазматической мембране». Biophysical Journal . 90 (8): 2843–2851. Bibcode :2006BpJ....90.2843S. doi :10.1529/biophysj.105.079574. PMC 1414554 . PMID  16443657. 
  16. ^ Sieber, JJ; KL Willig; R. Heintzmann; SW Hell; T. Lang (2006). «Мотив SNARE необходим для формирования кластеров синтаксина в плазматической мембране». Biophys. J . 90 (8): 2843–2851. Bibcode :2006BpJ....90.2843S. doi :10.1529/biophysj.105.079574. PMC 1414554 . PMID  16443657. 
  17. ^ Виллиг, КИ; Дж. Келлер; М. Босси; С.У. Хелл (2006). «STED-микроскопия разрешает сборки наночастиц». New J. Phys . 8 (6): 106. Bibcode : 2006NJPh....8..106W. doi : 10.1088/1367-2630/8/6/106 .
  18. ^ Wildanger, D.; Rittweger; Kastrup, L.; Hell, SW (2008). «STED-микроскопия с источником суперконтинуального лазера». Opt. Express . 16 (13): 9614–9621. Bibcode : 2008OExpr..16.9614W. doi : 10.1364/oe.16.009614 . PMID  18575529. S2CID  38016354.
  19. ^ Doonet, G.; J. Keller; CA Wurm; SO Rizzoli; V. Westphal; A. Schonle; R. Jahn; S. Jakobs; C. Eggeling; SW Hell (2007). "Двухцветная флуоресцентная наноскопия в дальнем поле". Biophys. J . 92 (8): L67–L69. Bibcode :2007BpJ....92L..67D. doi :10.1529/biophysj.107.104497. PMC 1831704 . PMID  17307826. 
  20. ^ ab Kasper, R.; B. Harke; C. Forthmann; P. Tinnefeld; SW Hell; M. Sauer (2010). "Single-Molecule STED Microscopy with Photostable Organic Fluorophores". Small . 6 (13): 1379–1384. doi :10.1002/smll.201000203. PMID  20521266.
  21. ^ Willig, KI; B. Harke; R. Medda; SW Hell (2007). «STED-микроскопия с непрерывными волновыми пучками». Nat. Methods . 4 (11): 915–918. doi :10.1038/nmeth1108. hdl : 11858/00-001M-0000-0012-DEE7-E . PMID  17952088. S2CID  5576096.
  22. ^ Бакерс, Дж.; Д. Уайлдангер; Г. Вичидомини; Л. Каструп; С. В. Хелл (2011). «Одновременная многоцветная STED-визуализация в течение многих лет для анализа колокализации». Opt. Express . 19 (4): 3130–3143. Bibcode : 2011OExpr..19.3130B. doi : 10.1364/OE.19.003130 . PMID  21369135. S2CID  38820566.
  23. ^ Halemani, ND; I. Bethani; SO Rizzoli; T. Lang (2010). «Структура и динамика двухспирального комплекса SNARE в живых клетках». Traffic . 11 (3): 394–404. doi : 10.1111/j.1600-0854.2009.01020.x . PMID  20002656. S2CID  22375304.
  24. ^ Geumann, U.; C. Schäfer; D. Riedel; R. Jahn; SO Rizzoli (2010). «Синаптические мембранные белки образуют стабильные микродомены в ранних эндосомах». Microsc. Res. Tech . 73 (6): 606–617. doi :10.1002/jemt.20800. PMID  19937745. S2CID  5278558.
  25. ^ Сингх, Х.; Р. Лу; ПФГ Родригес; И. Ву; Дж. К. Бопасса; Э. Стефани; Л. ТороMitochondrion (2012). «Визуализация и количественная оценка кластеров митохондриальных белков сердца с помощью STED-микроскопии». Mitochondrion . 12 (2): 230–236. doi :10.1016/j.mito.2011.09.004. PMC 3258335 . PMID  21982778. 
  26. ^ Wurm, CA; D. Neumann; R. Schmidt; A. Egner; S. Jakobs (2010). "Подготовка образцов для STED-микроскопии". Визуализация живых клеток . Методы в молекулярной биологии. Том 591. С. 185–199. doi :10.1007/978-1-60761-404-3_11. hdl :11858/00-001M-0000-0012-D68F-7. ISBN 978-1-60761-403-6. PMID  19957131.
  27. ^ Ким, Намду; Ким, Хён Джун; Ким, Ёнгю; Мин, Кён Сук; Ким, Сон Гын (2016). «Прямое и точное измерение длины отдельных растянутых фрагментов ДНК с помощью динамического молекулярного расчесывания и наноскопии STED». Аналитическая и биоаналитическая химия . 408 (23): 6453–6459. doi :10.1007/s00216-016-9764-9. PMID  27457103. S2CID  5591747.
  28. ^ Шарма, С.; К. Сантискулвонг; Л. Бентолила; Дж. Рао; О. Дориго; Дж. К. Гимзевски (2011). «Коррелятивное наномеханическое профилирование с визуализацией F-актина сверхвысокого разрешения раскрывает новые возможности понимания механизмов резистентности к цисплатину в клетках рака яичников». Наномедицина: нанотехнологии, биология и медицина . 8 (5): 757–766. doi :10.1016/j.nano.2011.09.015. PMID  22024198.
  29. ^ ab Hoopman, P.; A. Punge; SV Barysch; V. Westphal; J. Buchkers; F. Opazo; I. Bethani; MA Lauterbach; SW Hell; SO Rizzoli (2010). "Эндосомальная сортировка легко высвобождаемых синаптических пузырьков" (PDF) . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 107 (44): 19055–19060. Bibcode :2010PNAS..10719055H. doi : 10.1073/pnas.1007037107 . PMC 2973917 . PMID  20956291. 
  30. ^ Opazo, F.; A. Punge; J. Buckers; P. Hoopmann; L. Kastrup; SW Hell; SO Rizzoli (2010). «Ограниченное смешивание компонентов синаптических везикул при рециркуляции везикул». Traffic . 11 (6): 800–812. doi : 10.1111/j.1600-0854.2010.01058.x . PMID  20230528. S2CID  16847327.
  31. ^ Эггелинг, К.; Рингеманн, К.; Медда, Р.; Шварцманн, Г.; Сандхофф, К.; Полякова, С.; Белов, В. Н.; Хайн, Б.; фон Миддендорф, К.; Шёнле, А.; Хелл, С. В. (2009). «Прямое наблюдение наномасштабной динамики мембранных липидов в живой клетке». Nature . 457 (7233): 1159–1162. Bibcode :2009Natur.457.1159E. doi :10.1038/nature07596. hdl : 11858/00-001M-0000-0012-D8CA-4 . PMID  19098897. S2CID  4428863.
  32. ^ Willig, KI; RR Kellner; R. Medda; B. Heln; S. Jakobs; SW Hell (2006). «Наномасштабное разрешение в микроскопии на основе GFP». Nat. Methods . 3 (9): 721–723. doi :10.1038/nmeth922. hdl : 11858/00-001M-0000-0012-5CC4-1 . PMID  16896340. S2CID  9887386.
  33. ^ Hein, B.; KI Willig; SW Hell (2008). "Наноскопия с истощением стимулированного излучения (STED) органеллы, меченой флуоресцентным белком, внутри живой клетки". Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 105 (38): 14271–14276. Bibcode :2008PNAS..10514271H. doi : 10.1073/pnas.0807705105 . PMC 2538451 . PMID  18796604. 
  34. ^ Kleine-Vehn, J.; Wabnik, K.; Martiniere, A.; Langowski, L.; Willig, K.; Naramoto, S.; Leitner, J.; Tanaka, H.; Jakobs, S.; Robert, S.; Luschnig, C.; Govaerts, W.; Hell, SW; Runions, J.; Friml, J. (2011). "Recycling, clustering, and endocytosis togetherly keep PIN auxin carrier polarity at theplasmamembrance". Mol. Syst. Biol . 7 : 540. doi :10.1038/msb.2011.72. PMC 3261718 . PMID  22027551. 
  35. ^ Pellett, PA; X. Sun; TJ Gould; JE Rothman; MQ Xu; IR Corréa; J. Bewersdorf (2011 ) . «Двухцветная STED-микроскопия в живых клетках». Biomed. Opt. Express . 2 (8): 2364–2371. doi :10.1364/boe.2.002364. PMC 3149534. PMID  21833373. 
  36. ^ Стеффенс, Хайнц; Вегнер, Ваджа; Виллиг, Катрин И. (2020-03-01). «STED-микроскопия in vivo: дорожная карта для получения наномасштабных изображений у живых мышей». Методы . 174 : 42–48. doi : 10.1016/j.ymeth.2019.05.020 . ISSN  1095-9130. PMID  31132408.
  37. ^ Steffens, Heinz; Mott, Alexander C.; Li, Siyuan; Wegner, Waja; Švehla, Pavel; Kan, Vanessa WY; Wolf, Fred; Liebscher, Sabine; Willig, Katrin I. (2021). «Стабильный, но не жесткий: хроническая in vivo STED-наноскопия выявляет обширное ремоделирование шипиков, что указывает на множественные драйверы пластичности». Science Advances . 7 (24). Bibcode : 2021SciA....7.2806S. doi : 10.1126/sciadv.abf2806. ISSN  2375-2548. PMC 8189587. PMID 34108204  . 
  38. ^ Вегнер, Ваджа; Стеффенс, Хайнц; Грегор, Карола; Вольф, Фред; Виллиг, Катрин И. (2021-09-15). «Обогащение окружающей среды усиливает формирование паттернов и ремоделирование синаптической наноархитектуры, выявленное с помощью наноскопии STED». bioRxiv : 2020.10.23.352195. doi : 10.1101/2020.10.23.352195 . S2CID  237538532.
  39. ^ Вестфаль, В.; М. А. Лаутербах; А. Ди Никола; С. В. Хелл (2007). "Динамическая флуоресцентная наноскопия в дальнем поле". New J. Phys . 9 (12): 435. Bibcode :2007NJPh....9..435W. doi : 10.1088/1367-2630/9/12/435 .
  40. ^ Лаутербах, МА; Чайтанья К. Уллал; Фолькер Вестфаль; Стефан В. Хелл (2010). «Динамическая визуализация коллоидно-кристаллических наноструктур со скоростью 200 кадров в секунду». Langmuir . 26 (18): 14400–14404. doi : 10.1021/la102474p . PMID  20715873.
  41. ^ Hotta, JI; E. Fron; P. Dedecker; KPF Janssen; C. Li; K. Mullen; B. Harke; J. Buckers; SW Hell; J. Hofkens (2010). «Спектроскопическое обоснование эффективных флуорофоров для микроскопии истощения стимулированной эмиссии». J. Am. Chem. Soc . 132 (14): 5021–5023. doi :10.1021/ja100079w. hdl : 11858/00-001M-0000-0010-9310-1 . PMID  20307062.
  42. ^ Фогельсанг, Дж.; Р. Каспер; К. Шрейнхауэр; Б. Человек; М. Хайлеманн; М. Зауэр; П. Тиннеделд (2008). «Ein System aus Reduktions‐ und Oxidationsmittel verringert Photobleichen und Blinken von Fluoreszenzfarbstoffen». Энджью. Хим . 120 (29): 5545–5550. дои : 10.1002/ange.200801518.
  43. ^ Vogelsang, J.; R. Kasper; C. Sreinhauer; B. Person; M. Heilemann; M. Sauer; P. Tinnedeld (2008). «Восстанавливающая и окислительная система минимизирует фотообесцвечивание и мерцание флуоресцентных красителей». Angew. Chem. Int. Ed . 47 (29): 5465–5469. doi :10.1002/anie.200801518. PMID  18601270.

Внешние ссылки

На Викискладе есть медиафайлы по теме STED-микроскопия .