Плазмидная подготовка — это метод извлечения и очистки плазмидной ДНК . Это важный шаг во многих экспериментах по молекулярной биологии , необходимый для успешного использования плазмид в исследованиях и биотехнологии . [1] [2] Было разработано много методов для очистки плазмидной ДНК от бактерий . [1] [3] Во время процедуры очистки плазмидная ДНК часто отделяется от загрязняющих белков и геномной ДНК.
Эти методы неизменно включают три этапа: рост бактериальной культуры, сбор и лизис бактерий и очистка плазмидной ДНК. [4] Очистка плазмид является центральной для молекулярного клонирования . Очищенная плазмида может использоваться для многих стандартных приложений, таких как секвенирование и трансфекция в клетки.
Плазмиды почти всегда очищаются из жидких культур бактерий , обычно E. coli , которые были трансформированы и выделены. [5] [6] Практически все плазмидные векторы, которые обычно используются, кодируют один или несколько генов устойчивости к антибиотикам в качестве селективного маркера , например, ген, кодирующий устойчивость к ампициллину или канамицину, что позволяет бактериям, которые были успешно трансформированы, размножаться беспрепятственно. [7] [8] [9] Предполагается, что бактерии, которые не приняли плазмидный вектор, не имеют гена устойчивости, и, таким образом, ожидается, что будут расти только колонии, представляющие успешные трансформации. [5] [9] [10] Бактерии выращиваются в благоприятных условиях.
Существует несколько методов лизиса клеток, включая щелочной лизис, механический лизис и ферментативный лизис. [11] [12] [13] [14]
Наиболее распространенным методом является щелочной лизис, который включает использование высокой концентрации основного раствора, такого как гидроксид натрия , для лизиса бактериальных клеток. [15] [16] [17] Когда бактерии лизируются в щелочных условиях (pH 12,0–12,5), как хромосомная ДНК, так и белок денатурируются; однако плазмидная ДНК остается стабильной. [16] [17] Некоторые ученые снижают концентрацию NaOH до 0,1 М, чтобы уменьшить возникновение одноцепочечной ДНК . После добавления нейтрализующего буфера, содержащего ацетат, для снижения pH примерно до 7, большая и менее суперспирализованная хромосомная ДНК и белки образуют большие комплексы и выпадают в осадок; но небольшие бактериальные плазмиды ДНК остаются в растворе. [17] [14]
Механический лизис подразумевает использование физической силы, такой как измельчение или обработка ультразвуком , для разрушения бактериальных клеток и высвобождения плазмидной ДНК. Существует несколько различных методов механического лизиса, которые можно использовать, включая французский пресс , дробление шариками и ультразвуковую обработку . [11] [12] [13] [14]
Ферментативный лизис, также называемый лизисом лизоцима , включает использование ферментов для переваривания клеточной стенки и высвобождения плазмидной ДНК. [11] Наиболее часто используемым ферментом для этой цели является лизоцим, который расщепляет пептидогликан в клеточной стенке грамположительных бактерий . Лизоцим обычно добавляют в бактериальную культуру, после чего следует нагревание и/или встряхивание культуры для высвобождения плазмидной ДНК. [11] [12] [13] [14]
Подготовка плазмиды может быть разделена на пять основных категорий в зависимости от масштаба подготовки: миниподготовка, мидиподготовка, максиподготовка, мегаподготовка и гигаподготовка. Выбор метода будет зависеть от требуемого количества плазмидной ДНК, а также от конкретного применения, для которого она будет использоваться. [18] [19]
Наборы для очистки плазмидной ДНК доступны от разных производителей, которые названы по размеру бактериальной культуры и соответствующему выходу плазмиды. В порядке возрастания они следующие: miniprep, midiprep, maxiprep, megaprep и gigaprep. Выход плазмидной ДНК будет варьироваться в зависимости от количества копий плазмиды, типа и размера, бактериального штамма , условий роста и набора. [2]
Минипрепарат плазмидной ДНК — это быстрая, мелкомасштабная изоляция плазмидной ДНК из бактерий . [20] [21] Обычно используемые методы минипрепарата включают щелочной лизис и наборы на основе спин-колонок . [3] [22] Он основан на методе щелочного лизиса . Извлеченная плазмидная ДНК, полученная в результате выполнения минипрепарата, сама по себе часто называется «минипрепом». Минипрепы используются в процессе молекулярного клонирования для анализа бактериальных клонов . Типичный выход плазмидной ДНК минипрепа составляет от 5 до 50 мкг в зависимости от штамма клеток. Минипреп большого количества плазмид также можно удобно сделать на фильтровальной бумаге, лизируя клетку и элюируя плазмиду на фильтровальной бумаге. [21]
Начальный объем культуры E. coli составляет 15–25 мл бульона лизогении (LB), а ожидаемый выход ДНК — 100–350 мкг.
Начальный объем культуры E. coli составляет 100–200 мл LB, а ожидаемый выход ДНК — 500–850 мкг.
Начальный объем культуры E. coli составляет 500 мл – 2,5 л LB, а ожидаемый выход ДНК – 1,5–2,5 мг.
Начальный объем культуры E. coli составляет 2,5–5 л LB, а ожидаемый выход ДНК — 7,5–10 мг.
Важно учитывать последующие применения плазмидной ДНК при выборе метода очистки. Например, если плазмида будет использоваться для трансфекции или электропорации , желателен метод очистки, который приводит к высокой чистоте и низкому уровню эндотоксинов. Аналогично, если плазмида будет использоваться для секвенирования или ПЦР, желателен метод очистки, который приводит к высокому выходу и минимальному количеству загрязняющих веществ. [2] Однако существует несколько методов очистки нуклеиновых кислот. [23] [24] [25] Все они работают по принципу создания условий, в которых либо осаждается только нуклеиновая кислота, либо осаждаются только другие биомолекулы , что позволяет отделить нуклеиновую кислоту. [15] [23]
Осаждение этанолом является широко используемым методом очистки и концентрирования нуклеиновых кислот , включая плазмидную ДНК. [26] Основной принцип этого метода заключается в том, что нуклеиновые кислоты нерастворимы в этаноле или изопропаноле, но растворимы в воде. Поэтому он работает, используя этанол в качестве антирастворителя ДНК, заставляя ее осаждаться из раствора, а затем ее можно собрать центрифугированием . Растворимая фракция отбрасывается для удаления других биомолекул. [27]
Очистка нуклеиновых кислот на основе спин-колонок — это метод очистки ДНК, РНК или плазмиды из образца с использованием фильтра спин-колонок. [25] Метод основан на принципе селективного связывания нуклеиновых кислот с твердой матрицей в спин-колонке, в то время как другие загрязняющие вещества, такие как белки и соли, смываются. Затем условия изменяются для элюирования очищенной нуклеиновой кислоты из колонки с использованием подходящего элюирующего буфера. [25]
Основной принцип экстракции фенолом-хлороформом заключается в том, что ДНК и РНК относительно нерастворимы в феноле и хлороформе, в то время как другие клеточные компоненты относительно растворимы в этих растворителях. Добавление смеси фенола и хлороформа растворит белковые и липидные загрязняющие вещества, оставив нуклеиновые кислоты в водной фазе. Это также денатурирует белки, такие как ДНКаза , что особенно важно, если плазмиды будут использоваться для ферментативного переваривания. В противном случае может произойти размазывание в ферментативно-ограниченной форме плазмидной ДНК. [24]
При экстракции на основе бусинок добавление смеси, содержащей магнитные бусины, обычно состоящие из ионов железа , связывается с плазмидной ДНК, отделяя их от нежелательных соединений с помощью магнитного стержня или подставки. [25] Связанные с плазмидой бусины затем высвобождаются путем удаления магнитного поля и извлекаются в элюирующий раствор для последующих экспериментов, таких как трансформация или рестрикционное расщепление . Эта форма минипрепа также может быть автоматизирована, что повышает удобство и снижает механическую ошибку.