Митопласт — это митохондрия , лишенная внешней мембраны, при этом внутренняя мембрана и матрикс остались нетронутыми. [1]
Чтобы начать процесс, митохондрии сначала должны быть отделены от культивируемых клеток . Обычно это двухэтапный процесс с использованием гомогенизации для высвобождения межклеточного содержимого и дифференциального центрифугирования для отделения митохондрий от других органелл . После того, как митохондрии изолированы, можно сформировать митопласты. Митопласты чаще всего формируются с помощью аппарата, называемого френч-прессом . Когда митохондрии проходят через узкий клапан френч-пресса, они испытывают чрезвычайно высокое давление около 2000 фунтов на квадратный дюйм, которое разрывает внешнюю митохондриальную мембрану. Затем митопласты осаждаются и хранятся в специальном буфере для хранения до использования. Когда митопласты нужны, их просто помещают в инкубационный буфер хлорида калия (KCl), который заставляет митохондриальный матрикс набухать. В результате набухания внутренняя мембрана будет выступать из внешней мембраны, образуя одну из двух различных форм. [2] Митопласты, полученные методом французского прессования, обычно образуют двудольную везикулу и имеют форму, похожую на цифру 8. [3] Эти митопласты в форме цифры 8 являются предпочтительными, поскольку считаются наиболее здоровыми. Однако могут также образовываться митопласты в форме О, но этот тип не является предпочтительным для экспериментального использования, поскольку они часто скомпрометированы.
Научное понимание митохондрий значительно возросло с 1930-х годов благодаря развитию электронного микроскопа . К началу 1950-х годов ученые смогли установить, что митохондрии имеют две различные мембраны. Однако, поскольку исследования митохондрий были в основном сосредоточены на цепи переноса электронов и окислительном фосфорилировании , только спустя десятилетие были разработаны методы разделения двух митохондриальных мембран друг от друга.
В середине-конце 1960-х годов несколько независимых лабораторий заявили, что им удалось успешно разделить внешнюю митохондриальную мембрану и внутреннюю митохондриальную мембрану. В марте 1967 года группа исследователей из Лаборатории физиологии питания во Франции опубликовала статью, в которой обсуждались их исследования ферментативной активности внешней митохондриальной мембраны. Поскольку их исследования требовали изоляции внешней митохондриальной мембраны, был также описан метод, основанный на последовательных действиях дигитонина и обработки ультразвуком для разделения двух митохондриальных мембран. Чтобы завершить процедуру выделения, сырая фракция внешней мембраны была очищена с помощью дифференциального центрифугирования. [4] Примерно год спустя, в июле 1968 года, группа исследователей из кафедры физиологической химии Медицинской школы Джонса Хопкинса опубликовала статью, описывающую их метод разделения митохондриальных мембран в печени крысы, также с использованием дигитонина и дифференциального центрифугирования. В дополнение к разделению внешней и внутренней мембран, они смогли дополнительно разделить внутреннюю мембрану и матрикс посредством обработки неионным детергентом под названием Lubrol. Этот процесс затем позволил рассчитать относительное содержание белка в каждом компоненте митохондрий. [5] Обоснованием в обеих статьях использования низких концентраций дигитонина для отделения внешней митохондриальной мембраны было то, что внешняя мембрана была богата холестерином , который заставил бы ее связываться с дигитонином. После дальнейшего изучения исследовательская группа из Университета Джонса Хопкинса смогла усовершенствовать свой метод подготовки митопластов для получения митохондрий без внешней мембраны и с относительно неповрежденной внутренней мембраной и матриксом.
Другая процедура подготовки митопластов, описанная двумя дополнительными исследовательскими группами, использовала избирательное сокращение внутренней мембраны после того, как митохондрии печени подвергались циклу набухания-сокращения. Во время этой процедуры набухшая внешняя мембрана разрывалась либо спонтанно, либо идеально после того, как подвергалась мягкой обработке ультразвуком. После разрыва внешней мембраны компоненты внутренней мембраны можно было отделить от внешней мембраны с помощью дифференциального центрифугирования. [6] Эта процедура эффективна из-за явных различий между внешней и внутренней митохондриальными мембранами, в частности, касающихся осмотического поведения и проницаемости. Согласно обширным исследованиям, внутренняя мембрана способна реагировать на изменения осмотического давления путем развертывания и повторного сворачивания. Однако внешняя мембрана не показала обратимых реакций на изменения осмотического давления. Следовательно, растяжение и разрыв внешней мембраны является пассивным процессом, вызванным развертыванием внутренней мембраны из-за изменения осмотического давления.
Хотя в то время эти методы разделения доказали свою эффективность, их механическая природа устарела, поскольку были разработаны новые технологии, такие как френч-пресс, которые ускорили и упростили создание митопластов для исследователей.
Возможность для исследователей разделить две митохондриальные мембраны для формирования митопласта создала много новых возможностей для изучения митохондрий. Как упоминалось ранее, исследователи теперь могут рассчитать относительное содержание белка в каждом компоненте митохондрии. Кроме того, митопласты позволили определить внутримитохондриальное распределение ферментов, что ранее было невозможно, поскольку внутренняя мембрана была заключена во внешнюю мембрану. Поэтому вскоре после того, как митопласты удалось легко создать, стали доступны различные данные относительно почти всех ферментов, которые, как предполагалось, присутствовали в митохондриях.
Митопласты также полезны для электрофизиологического анализа митохондриальной функции, поскольку митохондрии могут сохранять нормальную функцию даже после удаления их внешней мембраны. В частности, электрофизиология с пэтч-клампом возникла как новый метод изучения функциональности внутренней мембраны. [7] Этот метод облегчает чувствительное измерение тока через мембрану, полезное для изучения цепи переноса электронов и утечки протонов (т. е. разъединения движения протонов по его электрохимическому градиенту и синтеза АТФ через АТФ-синтазу ).