Векторы трансформации растений — это плазмиды , специально разработанные для облегчения создания трансгенных растений . Наиболее часто используемые векторы трансформации растений — это бинарные векторы T-ДНК , которые часто реплицируются как в E. coli , обычной лабораторной бактерии , так и в Agrobacterium tumefaciens , вирулентной для растений бактерии, используемой для внедрения рекомбинантной ДНК в растения.
Векторы трансформации растений содержат три ключевых элемента:
Пользовательскую последовательность плазмид ДНК можно создать и реплицировать различными способами, но, как правило, все методы включают в себя следующие процессы:
Трансформация растений с использованием плазмид начинается с размножения бинарного вектора в E. coli. Когда бактериальная культура достигает соответствующей плотности, бинарный вектор выделяется и очищается. Затем может быть введен чужеродный ген. Сконструированный бинарный вектор, включающий чужеродный ген, повторно вводится в E. coli для амплификации.
Сконструированный бинарный фактор выделяется из E. coli и вводится в Agrobacteria , содержащую модифицированную (относительно небольшую) плазмиду Ti. Эта сконструированная Agrobacteria может использоваться для заражения растительных клеток. T-ДНК, которая содержит чужеродный ген, интегрируется в геном растительной клетки. В каждой инфицированной клетке T-ДНК интегрируется в другом месте генома.
Все растение регенерируется из одной трансформированной клетки, в результате чего получается организм с трансформированной ДНК, одинаково интегрированной во все клетки.
Ген-селектор может быть использован для различения успешно генетически модифицированных клеток от немодифицированных. Ген-селектор интегрируется в плазмиду вместе с желаемым целевым геном, обеспечивая клеткам устойчивость к антибиотику , такому как канамицин , ампициллин , спектиномицин или тетрациклин . Желаемые клетки, а также любые другие организмы, растущие в культуре, могут быть обработаны антибиотиком, что позволяет выжить только модифицированным клеткам. Ген-антибиотик обычно не переносится в растительную клетку, а вместо этого остается внутри бактериальной клетки.
Плазмиды реплицируются, чтобы произвести множество молекул плазмиды в каждой клетке бактерии-хозяина. Количество копий каждой плазмиды в бактериальной клетке определяется точкой начала репликации , которая является положением внутри молекулы плазмиды, где инициируется репликация ДНК. Большинство бинарных векторов имеют большее количество копий плазмиды, когда они реплицируются в E. coli ; однако, количество копий плазмиды обычно ниже, когда плазмида находится в Agrobacterium tumefaciens . Плазмиды также можно реплицировать с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
T-ДНК содержит два типа генов: онкогенные гены , кодирующие ферменты, участвующие в синтезе ауксинов и цитокининов и ответственные за образование опухолей , и гены, кодирующие синтез опинов . Эти соединения, образующиеся в результате конденсации аминокислот и сахаров, синтезируются и выделяются клетками корончатого галла, и они потребляются A. tumefaciens в качестве источников углерода и азота.
Гены, участвующие в катаболизме опинов , переносе Т-ДНК из бактерии в растительную клетку и конъюгативном переносе плазмиды бактерия-бактерия, расположены вне Т-ДНК. [3] [4] Фрагмент Т-ДНК фланкирован 25-пн прямыми повторами, которые действуют как цис-элементный сигнал для аппарата переноса. Процесс переноса Т-ДНК опосредован кооперативным действием белков, кодируемых генами, определенными в области вирулентности плазмиды Ti (гены vir) и в бактериальной хромосоме. Плазмида Ti также содержит гены катаболизма опинов, продуцируемые клетками корончатого галла, и области для конъюгативного переноса и для собственной целостности и стабильности. Регион вирулентности (vir) размером 30 кб представляет собой регулон, организованный в шесть оперонов, необходимых для переноса Т-ДНК (virA, virB, virD и virG) или для повышения эффективности переноса (virC и virE). [3] [4] [5] Несколько хромосомно-детерминированных генетических элементов показали свою функциональную роль в прикреплении A. tumefaciens к растительной клетке и бактериальной колонизации. Локусы chvA и chvB участвуют в синтезе и выделении β-1,2- глюкана , [6] chvE, необходимого для усиления сахара индукции генов vir и бактериального хемотаксиса . [7] [8] [9] Локус клетки отвечает за синтез целлюлозных фибрилл. [10] Локус pscA (exoC) участвует в синтезе как циклического глюкана, так и кислого сукциногликана . [11] [9] Локус att участвует в белках клеточной поверхности . [12]