Плазмида — это небольшая внехромосомная молекула ДНК внутри клетки, которая физически отделена от хромосомной ДНК и может реплицироваться независимо. Чаще всего они встречаются у бактерий в виде небольших кольцевых двухцепочечных молекул ДНК ; однако плазмиды иногда присутствуют у архей и эукариотических организмов . [1] [2] В природе плазмиды часто несут гены, которые способствуют выживанию организма и дают селективное преимущество, например устойчивость к антибиотикам . Хотя хромосомы большие и содержат всю необходимую генетическую информацию для жизни в нормальных условиях, плазмиды обычно очень малы и содержат только дополнительные гены, которые могут быть полезны в определенных ситуациях или условиях. Искусственные плазмиды широко используются в качестве векторов при молекулярном клонировании , обеспечивая репликацию последовательностей рекомбинантной ДНК в организмах-хозяевах. В лаборатории плазмиды можно вводить в клетку путем трансформации . Синтетические плазмиды доступны для приобретения через Интернет. [3] [4] [5]
Плазмиды считаются репликонами , единицами ДНК, способными автономно реплицироваться в подходящем хозяине. Однако плазмиды, как и вирусы , обычно не относят к жизни . [6] Плазмиды передаются от одной бактерии к другой (даже от другого вида) в основном посредством конъюгации . [7] Перенос генетического материала от хозяина к хозяину является одним из механизмов горизонтального переноса генов , а плазмиды считаются частью мобилома . В отличие от вирусов, которые заключают свой генетический материал в защитную белковую оболочку, называемую капсидом , плазмиды представляют собой «голую» ДНК и не кодируют гены, необходимые для упаковки генетического материала для передачи новому хозяину; однако некоторые классы плазмид кодируют конъюгативный «половой» пилус , необходимый для их собственной передачи. Плазмиды различаются по размеру от 1 до более 400 тыс. пар оснований [8] , а количество идентичных плазмид в одной клетке может варьироваться от одной до тысяч при некоторых обстоятельствах.
Термин «плазмида» был введен в 1952 году американским молекулярным биологом Джошуа Ледербергом для обозначения «любой внехромосомной наследственной детерминанты». [9] Раннее использование этого термина включало любой бактериальный генетический материал, который существует внехромосомно, по крайней мере, в течение части его цикла репликации, но поскольку это описание включает бактериальные вирусы, понятие плазмиды со временем было уточнено и теперь включает генетические элементы, которые размножаются автономно. [10] Позже, в 1968 году, было решено, что термин «плазмида» следует принять как термин для внехромосомного генетического элемента, [11] и, чтобы отличить его от вирусов, определение было сужено до генетических элементов, которые существуют исключительно или преимущественно вне хромосом. хромосоме и могут реплицироваться автономно. [10]
Чтобы плазмиды могли независимо реплицироваться внутри клетки, они должны обладать участком ДНК, который может выступать в качестве источника репликации . Самовоспроизводящаяся единица, в данном случае плазмида, называется репликоном . Типичный бактериальный репликон может состоять из ряда элементов, таких как ген плазмидного белка инициации репликации (Rep), повторяющихся единиц, называемых итеронами , блоков DnaA и прилегающей AT-богатой области. [10] Меньшие плазмиды используют репликативные ферменты хозяина для создания своих копий, в то время как более крупные плазмиды могут нести гены, специфичные для репликации этих плазмид. Некоторые типы плазмид также могут встраиваться в хромосому хозяина, и эти интегративные плазмиды у прокариот иногда называют эписомами . [12]
Плазмиды почти всегда несут хотя бы один ген. Многие из генов, переносимых плазмидой, полезны для клеток-хозяев, например: они позволяют клетке-хозяину выживать в среде, которая в противном случае была бы летальной или ограничивающей рост. Некоторые из этих генов кодируют признаки устойчивости к антибиотикам или устойчивости к тяжелым металлам, в то время как другие могут продуцировать факторы вирулентности , которые позволяют бактерии колонизировать хозяина и преодолевать его защиту, или имеют специфические метаболические функции, которые позволяют бактерии использовать определенное питательное вещество, включая способность разлагать неподатливые или токсичные органические соединения. [13] Плазмиды также могут обеспечивать бактериям способность фиксировать азот . Однако некоторые плазмиды не оказывают заметного влияния на фенотип клетки-хозяина или их польза для клеток-хозяев не может быть определена, и эти плазмиды называются загадочными плазмидами. [14]
Встречающиеся в природе плазмиды сильно различаются по своим физическим свойствам. Их размер может варьироваться от очень маленьких мини-плазмид размером менее 1 тысячи пар оснований (т.п.н.) до очень больших мегаплазмид из нескольких пар мегаоснований (МБП). На верхнем конце мегаплазмида и минихромосома мало чем отличаются . Плазмиды обычно имеют круглую форму, но известны также примеры линейных плазмид. Эти линейные плазмиды требуют специализированных механизмов для репликации своих концов. [10]
Плазмиды могут присутствовать в отдельной клетке в разном количестве — от одной до нескольких сотен. Нормальное количество копий плазмиды, которое может быть обнаружено в одной клетке, называется числом копий плазмиды и определяется тем, как регулируется инициация репликации, и размером молекулы. Более крупные плазмиды, как правило, имеют меньшее количество копий. [12] Плазмиды с низким числом копий, которые существуют только в виде одной или нескольких копий в каждой бактерии, при делении клеток рискуют потеряться в одной из сегрегирующих бактерий. Такие однокопийные плазмиды имеют системы, которые пытаются активно распространять копию в обе дочерние клетки. Эти системы, которые включают систему paraABS и систему parMRC , часто называют системой распределения или функцией распределения плазмиды. [15]
Плазмиды линейной формы среди фитопатогенов неизвестны , за одним исключением — Rhodococcus fascians . [16]
Плазмиды можно классифицировать по нескольким признакам. Плазмиды можно разделить на конъюгативные и неконъюгативные плазмиды. Конъюгативные плазмиды содержат набор генов-переносчиков , которые способствуют половой конъюгации между различными клетками. [12] В сложном процессе конъюгации плазмиды могут передаваться от одной бактерии к другой через половые пили , кодируемые некоторыми генами-переносчиками (см. Рисунок). [17] Неконъюгативные плазмиды не способны инициировать конъюгацию, поэтому их можно переносить только с помощью конъюгативных плазмид. Плазмиды промежуточного класса способны мобилизоваться и несут только подмножество генов, необходимых для переноса. Они могут паразитировать на конъюгативной плазмиде, передавая ее с высокой частотой только в ее присутствии. [ нужна цитата ]
Плазмиды также можно разделить на группы несовместимости. Микроб может содержать разные типы плазмид, но разные плазмиды могут существовать в одной бактериальной клетке только в том случае, если они совместимы. Если две плазмиды несовместимы, одна или другая будет быстро потеряна из клетки. Таким образом, разные плазмиды могут быть отнесены к разным группам несовместимости в зависимости от того, могут ли они сосуществовать вместе. Несовместимые плазмиды (принадлежащие к одной и той же группе несовместимости) обычно имеют одни и те же механизмы репликации или разделения и, следовательно, не могут храниться вместе в одной клетке. [18] [19]
Другой способ классификации плазмид – по функциям. Существует пять основных классов:
Плазмиды могут принадлежать более чем к одной из этих функциональных групп.
Хотя большинство плазмид представляют собой молекулы двухцепочечной ДНК, некоторые состоят из одноцепочечной ДНК или преимущественно двухцепочечной РНК . РНК-плазмиды представляют собой неинфекционные внехромосомные линейные репликоны РНК, как инкапсидированные, так и неинкапсидированные, которые обнаружены у грибов и различных растений, от водорослей до наземных растений. Однако во многих случаях бывает трудно или невозможно четко отличить РНК-плазмиды от РНК-вирусов и других инфекционных РНК. [20]
Хромиды - это элементы, которые существуют на границе между хромосомой и плазмидой, обнаруженные примерно у 10% видов бактерий, секвенированных к 2009 году. Эти элементы несут основные гены и имеют использование кодонов, аналогичное хромосоме, но используют механизм репликации плазмидного типа, такой как как малое количество копий RepABC. В результате в прошлом их по-разному классифицировали как минихромосомы или мегаплазмиды. [21] В Vibrio бактерия синхронизирует репликацию хромосомы и хромиды за счет консервативного соотношения размеров генома. [22]
Искусственно сконструированные плазмиды могут быть использованы в качестве векторов в генной инженерии . Эти плазмиды служат важными инструментами в лабораториях генетики и биотехнологии, где они обычно используются для клонирования и амплификации (создания множества копий) или экспрессии определенных генов. [23] Для таких целей коммерчески доступны самые разнообразные плазмиды. Ген, подлежащий репликации, обычно встраивают в плазмиду, которая обычно содержит ряд особенностей для их использования. К ним относятся ген, который придает устойчивость к определенным антибиотикам ( для бактериальных штаммов чаще всего используется ампициллин ), точка начала репликации , позволяющая бактериальным клеткам реплицировать плазмидную ДНК, и подходящий сайт для клонирования (называемый сайтом множественного клонирования). ).
Структурную нестабильность ДНК можно определить как серию спонтанных событий, кульминацией которых является непредвиденная перестройка, потеря или приобретение генетического материала. Такие события часто вызываются транспозицией мобильных элементов или наличием нестабильных элементов, таких как неканонические (не-B) структуры. Акцессорные области, относящиеся к бактериальному остову, могут участвовать в широком спектре явлений структурной нестабильности. Хорошо известные катализаторы генетической нестабильности включают прямые, инвертированные и тандемные повторы, которые, как известно, заметны в большом количестве коммерчески доступных векторов клонирования и экспрессии. [24] Инсерционные последовательности также могут серьезно влиять на функцию и урожайность плазмид, приводя к делециям и реаранжировкам, активации, подавлению или инактивации экспрессии соседних генов . [25] Таким образом, уменьшение или полное устранение посторонних некодирующих последовательностей основной цепи заметно снизило бы склонность к таким событиям и, следовательно, общий рекомбиногенный потенциал плазмиды. [26] [27]
Плазмиды являются наиболее часто используемыми векторами для клонирования бактерий. [28] Эти векторы клонирования содержат сайт, который позволяет вставлять фрагменты ДНК, например, сайт множественного клонирования или полилинкер, который имеет несколько обычно используемых сайтов рестрикции , с которыми могут быть лигированы фрагменты ДНК . После того, как интересующий ген вставлен, плазмиды вводятся в бактерии посредством процесса, называемого трансформацией . Эти плазмиды содержат селектируемый маркер , обычно ген устойчивости к антибиотикам, который придает бактериям способность выживать и размножаться в селективной питательной среде, содержащей определенные антибиотики. Клетки после трансформации подвергаются воздействию селективной среды, и выжить могут только клетки, содержащие плазмиду. Таким образом, антибиотики действуют как фильтр, отбирая только бактерии, содержащие плазмидную ДНК. Вектор также может содержать другие маркерные гены или репортерные гены для облегчения отбора плазмид с клонированными вставками. Бактерии, содержащие плазмиду, затем можно вырастить в больших количествах, собрать, а затем выделить интересующую плазмиду с использованием различных методов получения плазмиды .
Плазмидный вектор клонирования обычно используется для клонирования фрагментов ДНК размером до 15 т.п.н. [29] Для клонирования более длинных участков ДНК используются лямбда-фаги с удаленными генами лизогении, космиды , бактериальные искусственные хромосомы или дрожжевые искусственные хромосомы .
Еще одним важным применением плазмид является производство большого количества белков. В этом случае исследователи выращивают бактерии, содержащие плазмиду, содержащую интересующий ген. Так же, как бактерия вырабатывает белки, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам, ее также можно заставить производить большое количество белков из встроенного гена. Это дешевый и простой способ массового производства белка, который кодирует ген, например, инсулина .
Плазмиды также можно использовать для переноса генов в качестве потенциального средства генной терапии , чтобы они могли экспрессировать белок, которого не хватает в клетках. Некоторые формы генной терапии требуют введения терапевтических генов в заранее выбранные хромосомные участки генома человека . Плазмидные векторы являются одним из многих подходов, которые можно использовать для этой цели. Нуклеазы цинковых пальцев (ZFN) позволяют вызвать сайт-специфический двухцепочечный разрыв генома ДНК и вызвать гомологичную рекомбинацию . Плазмиды, кодирующие ZFN, могут помочь доставить терапевтический ген в определенное место, чтобы избежать повреждения клеток , мутаций, вызывающих рак, или иммунного ответа . [30]
Плазмиды исторически использовались для генетической инженерии эмбриональных стволовых клеток крыс для создания моделей генетических заболеваний крыс. Ограниченная эффективность методов на основе плазмид не позволяла использовать их для создания более точных моделей клеток человека. Однако разработки в области методов рекомбинации аденоассоциированных вирусов и нуклеаз с цинковыми пальцами позволили создать новое поколение моделей изогенных заболеваний человека .
Термин «эпизома» был введен Франсуа Жакобом и Эли Уоллманом в 1958 году для обозначения внехромосомного генетического материала, который может реплицироваться автономно или интегрироваться в хромосому. [31] [32] Однако с момента появления этого термина его использование изменилось, поскольку плазмида стала предпочтительным термином для автономной репликации внехромосомной ДНК. На симпозиуме 1968 года в Лондоне некоторые участники предложили отказаться от термина « эпизома» , хотя другие продолжали использовать этот термин, изменив его значение. [33] [34]
Сегодня некоторые авторы используют эписому в контексте прокариот для обозначения плазмиды, способной интегрироваться в хромосому. Интегративные плазмиды могут реплицироваться и стабильно сохраняться в клетке на протяжении нескольких поколений, но на каком-то этапе они будут существовать как независимая плазмидная молекула. [35] В контексте эукариот термин эписома используется для обозначения неинтегрированной внехромосомной замкнутой кольцевой молекулы ДНК, которая может реплицироваться в ядре. [36] [37] Наиболее распространенными примерами этого являются вирусы, такие как герпесвирусы , аденовирусы и полиомавирусы , но некоторые из них являются плазмидами. Другие примеры включают аберрантные хромосомные фрагменты, такие как двухминутные хромосомы , которые могут возникнуть во время искусственной амплификации генов или в патологических процессах (например, трансформации раковых клеток). Эписомы у эукариот ведут себя аналогично плазмидам у прокариот в том смысле, что ДНК стабильно сохраняется и реплицируется с клеткой-хозяином. Также могут встречаться цитоплазматические вирусные эписомы (как при поксвирусных инфекциях). Некоторые эписомы, такие как вирусы герпеса, реплицируются по механизму катящегося круга , подобно бактериофагам (бактериальным фаговым вирусам). Другие реплицируются посредством механизма двунаправленной репликации ( плазмиды типа Тета ). В любом случае эписомы остаются физически отделенными от хромосом клетки-хозяина. Некоторые раковые вирусы, в том числе вирус Эпштейна-Барра и герпесвирус, ассоциированный с саркомой Капоши , сохраняются в виде латентных, хромосомно различных эписом в раковых клетках, где вирусы экспрессируют онкогены , которые способствуют пролиферации раковых клеток. При раке эти эписомы пассивно реплицируются вместе с хромосомами хозяина при делении клетки. Когда эти вирусные эписомы инициируют литическую репликацию с образованием множества вирусных частиц, они обычно активируют защитные механизмы клеточного врожденного иммунитета , которые убивают клетку-хозяина.
Некоторые плазмиды или микробные хозяева включают систему привыкания или постсегрегационную систему уничтожения (PSK), такую как система хок/сок (убийство хозяина/подавитель уничтожения) плазмиды R1 в Escherichia coli . [38] Этот вариант производит как долгодействующий яд , так и кратковременное противоядие . Несколько типов плазмидных аддитивных систем (токсин/антитоксин, метаболизм, ОРТ) описаны в литературе [39] и используются в биотехнических (ферментация) или биомедицинских (вакцинотерапия) приложениях. Дочерние клетки, сохраняющие копию плазмиды, выживают, в то время как дочерняя клетка, которая не может унаследовать плазмиду, умирает или страдает от снижения скорости роста из-за сохраняющегося яда родительской клетки. Наконец, можно повысить общую производительность.
Напротив, плазмиды, используемые в биотехнологии, такие как pUC18, pBR322 и производные векторы, почти никогда не содержат системы зависимости токсин-антитоксин, и поэтому их необходимо хранить под давлением антибиотиков, чтобы избежать потери плазмиды.
Дрожжи естественным образом содержат различные плазмиды. Среди них следует отметить плазмиды размером 2 мкм — небольшие круглые плазмиды, часто используемые для генной инженерии дрожжей, — и линейные плазмиды pGKL из Kluyveromyces Lactis , которые отвечают за фенотипы-киллеры. [40]
Другие типы плазмид часто связаны с векторами клонирования дрожжей, которые включают:
Митохондрии многих высших растений содержат самореплицирующиеся внехромосомные линейные или кольцевые молекулы ДНК, которые считаются плазмидами. Их размер может варьироваться от 0,7 до 20 КБ. Плазмиды обычно подразделяют на две категории: кольцевые и линейные. [41] Круглые плазмиды были изолированы и обнаружены во многих различных растениях, причем наиболее изученными являются плазмиды Vicia faba и Chenopodium album , механизм репликации которых известен. Кольцевые плазмиды могут реплицироваться с использованием θ-модели репликации (как у Vicia faba ) и посредством репликации по катящемуся кругу (как у C.album ). [42] Линейные плазмиды были идентифицированы у некоторых видов растений, таких как Beta vulgaris , Brassica napus , Zea mays и т. д., но встречаются реже, чем их круглые аналоги.
Функция и происхождение этих плазмид остаются в значительной степени неизвестными. Было высказано предположение, что кольцевые плазмиды имеют общего предка; некоторые гены в митохондриальной плазмиде имеют аналоги в ядерной ДНК, что позволяет предположить межотделенный обмен. Между тем, линейные плазмиды имеют структурное сходство, такое как инвертроны, с вирусной ДНК и грибковыми плазмидами, как и грибковые плазмиды, они также имеют низкое содержание GC. Эти наблюдения привели к некоторой гипотезе о том, что эти линейные плазмиды имеют вирусное происхождение или оказались в митохондриях растений. путем горизонтального переноса генов от патогенных грибов. [41] [43]
Плазмиды часто используются для очистки определенной последовательности, поскольку их можно легко очистить от остального генома. Для использования в качестве векторов и для молекулярного клонирования плазмиды часто необходимо изолировать.
Существует несколько методов выделения плазмидной ДНК из бактерий: от минипрепа до максипрепа или объемного препарирования . [23] Первый можно использовать, чтобы быстро выяснить, правильна ли плазмида в любом из нескольких бактериальных клонов. Выход представляет собой небольшое количество нечистой плазмидной ДНК, которого достаточно для анализа методом рестрикции и для некоторых методов клонирования.
В последнем выращиваются гораздо большие объемы бактериальной суспензии, из которых можно провести макси-препарат. По сути, это увеличенный минипрепарат с последующей дополнительной очисткой. В результате получают относительно большие количества (несколько сотен микрограмм) очень чистой плазмидной ДНК.
Было создано множество коммерческих наборов для экстракции плазмид в различных масштабах, чистоте и уровнях автоматизации.
Плазмидная ДНК может иметь одну из пяти конформаций, которые (для данного размера) движутся с разной скоростью в геле во время электрофореза . Конформации перечислены ниже в порядке электрофоретической подвижности (скорости для данного приложенного напряжения) от самой медленной до самой быстрой:
Скорость миграции небольших линейных фрагментов прямо пропорциональна приложенному напряжению при низких напряжениях. При более высоких напряжениях более крупные фрагменты мигрируют с постоянно возрастающей, но разной скоростью. Таким образом, разрешение геля уменьшается с увеличением напряжения.
При заданном низком напряжении скорость миграции небольших линейных фрагментов ДНК зависит от их длины. Большие линейные фрагменты (более 20 КБ или около того) мигрируют с определенной фиксированной скоростью независимо от длины. Это происходит потому, что молекулы «дышат», при этом основная часть молекулы следует за ведущим концом через матрицу геля. Рестрикционные гидролизаты часто используются для анализа очищенных плазмид. Эти ферменты специфически разрушают ДНК на определенных коротких участках. Полученные линейные фрагменты после гель-электрофореза образуют «полосы» . Можно очистить определенные фрагменты, вырезав полосы из геля и растворив гель для высвобождения фрагментов ДНК.
Из-за своей плотной конформации сверхспиральная ДНК мигрирует через гель быстрее, чем линейная или разомкнутая кольцевая ДНК.
Использование плазмид в качестве метода молекулярной биологии поддерживается программным обеспечением для биоинформатики . Эти программы записывают последовательность ДНК плазмидных векторов, помогают предсказывать места разреза ферментов рестрикции и планировать манипуляции. Примерами пакетов программного обеспечения, обрабатывающих плазмидные карты, являются ApE, Clone Manager , GeneConstructionKit, Geneious, Genome Compiler , LabGenius, Lasergene, MacVector , pDraw32, Serial Cloner, VectorFriends, Vector NTI и WebDSV. Эти программы помогают проводить целые эксперименты в silico, прежде чем приступать к влажным экспериментам. [44]
За прошедшие годы было создано множество плазмид, и исследователи передали плазмиды базам данных плазмид, таким как некоммерческие организации Addgene и BCCM/LMBP. В этих базах данных можно найти и запросить плазмиды для исследования. Исследователи также часто загружают последовательности плазмид в базу данных NCBI, из которой можно получить последовательности конкретных плазмид.
{{cite journal}}
: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )