stringtranslate.com

Его-тег

Простая гравитационная колонка для Ni 2+ - аффинной хроматографии . Образец и последующие буферы вручную заливаются в колонку и собираются в нижнем конце после прохождения через слой смолы (светло-голубого цвета у основания колонки).

Полигистидиновый -тег , наиболее известный под торговым названием His-тег , представляет собой аминокислотный мотив в белках , который обычно состоит из по крайней мере шести остатков гистидина ( His ), часто на N- или C-конце белка. Он также известен как гексагистидиновый-тег , 6xHis-тег или His6-тег . Тег был изобретен Roche , [1] хотя использование гистидинов и его векторов распространяется Qiagen . Различные наборы для очистки белков с гистидиновыми тегами коммерчески доступны у нескольких компаний. [2]

Общее количество остатков гистидина в теге может варьироваться от двух до 10 и более остатков His. За N- или C-концевыми His-тегами может также следовать или предшествовать, соответственно, подходящая аминокислотная последовательность , которая облегчает удаление полигистидинового тега с помощью эндопептидаз . Эта дополнительная последовательность не является необходимой, если для удаления N-концевых His-тегов используются экзопептидазы (например, Qiagen TAGZyme). Кроме того, расщепление экзопептидазой может решить проблему неспецифического расщепления, наблюдаемого при использовании удаления тегов на основе эндопротеазы. Полигистидиновые теги часто используются для аффинной очистки генетически модифицированных белков.

Принцип

Три вида рентгеновской структуры Ni(NTA)(H 2 O) 2 [ необходима ссылка ]

Белки могут координировать ионы металлов на своей поверхности, и можно разделять белки с помощью хроматографии, используя разницу в их сродстве к ионам металлов. Это называется аффинной хроматографией с иммобилизованными ионами металлов (IMAC), первоначально представленной в 1975 году под названием аффинная хроматография с металлическими хелатами. [3] Последующие исследования показали, что среди аминокислот, составляющих белки, гистидин активно участвует в координационном комплексе с ионами металлов. [4] Поэтому, если к концу белка добавить несколько гистидинов, сродство белка к иону металла увеличивается, и это можно использовать для селективного выделения интересующего белка. Когда белок с His-тегом контактирует с носителем, на котором иммобилизован ион металла, такой как никель, остаток гистидина хелатирует ион металла и связывается с носителем. Поскольку другие белки не связываются с носителем или связываются очень слабо, их можно удалить, промыв носитель соответствующим буфером. Затем белок с полигистидиновой меткой можно восстановить, элюируя его со смолы. [5]

Практический выбор

Длина тега

Примеры методов добавления полигистидиновых меток . ( A ) Полигистидиновая метка добавляется путем вставки ДНК, кодирующей интересующий белок, в вектор, который имеет метку, готовую к слиянию на С-конце. ( B ) Полигистидиновая метка добавляется с использованием праймеров, содержащих кодирующую метку последовательность в качестве выступа на прямом праймере. После ПЦР-амплификации метка присутствует на N-конце гена, который затем может быть субклонирован в вектор экспрессии.

Полигистидиновые метки чаще всего состоят из шести остатков гистидина. Метки с двенадцатью остатками гистидина или двойные метки, прикрепленные через короткий линкер, не являются редкостью и могут улучшить результаты очистки за счет усиления связывания с аффинной смолой, что позволяет повысить строгость промывки и отделения от эндогенных белков. [6] [7] [8] Метка может быть добавлена ​​к интересующему гену с использованием методов, общих для большинства меток очистки . Самый простой метод - субклонировать интересующий ген в вектор, содержащий последовательность полигистидиновой метки. Многие векторы для использования с различными системами экспрессии доступны с полигистидиновыми метками в различных положениях и с различными сайтами расщепления протеазой, другими метками и т. д . [9] Однако, если подходящий вектор недоступен или метку необходимо вставить в место, отличное от N- или C-конца белка, интересующий ген может быть либо напрямую синтезирован, содержащий последовательности полигистидиновых меток, либо могут быть использованы различные методы на основе ПЦР для добавления метки к гену. Распространенный подход заключается в добавлении кодирующей последовательности для полигистидиновых меток к праймерам ПЦР в качестве выступа. [10] [11]

Позиция тега

Чаще всего полигистидиновая метка сливается с N-концом или C-концом белка и присоединяется через короткий гибкий линкер, который может содержать сайт расщепления протеазой. [10] [9] Реже метки могут быть добавлены как на N-, так и на C-конец или вставлены в промежуточную часть белка, например, в открытую петлю. [12] [8] Выбор положения метки зависит от свойств каждого белка и выбранной стратегии очистки; может потребоваться протестировать несколько конструкций с меткой в ​​разных положениях. [6] [10] Хотя считается, что полигистидиновые метки обычно не изменяют свойства белка, было продемонстрировано, что добавление метки может вызвать нежелательные эффекты, такие как влияние на олигомерное состояние белка. [13]

Матрицы-носители

На рынке представлены различные матрицы-носители, связанные с твердой смоляной подложкой, которые впоследствии могут быть заряжены катионом металла. Для этой цели чаще всего используются производные иминодиуксусной кислоты (IDA) и нитрилотриуксусной кислоты (NTA) , причем разные матрицы имеют определенные преимущества и недостатки для различных применений. [14]

Ионы металлов

Несколько металлических катионов имеют высокое сродство к имидазолу, функциональной группе His-тега. Двухвалентные катионы M2 + (M = Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn и т. д. ) комплексы переходных металлов с имидазолом чаще всего используются для этой цели. Выбор катиона, как правило, является компромиссом между связывающей способностью и чистотой. Никель часто используется, поскольку он обеспечивает хороший баланс между этими факторами, в то время как кобальт может использоваться, когда желательно повысить чистоту очистки, поскольку он имеет меньшее сродство к эндогенным белкам; связывающая способность, однако, ниже по сравнению с никелем. [14] [10]

Метод элюирования

Для того, чтобы элюировать His-меченый белок из носителя, существует несколько потенциальных методов, которые могут быть использованы в комбинации, если это необходимо. Чтобы избежать денатурации белков, обычно желательно использовать как можно более мягкий метод.

Для высвобождения His-меченого белка из носителя используется соединение, имеющее структуру, похожую на His-метку, и которое также образует координационный комплекс с иммобилизованными ионами металла. Такое соединение, добавленное к His-меченому белку на носителе, конкурирует с белком за иммобилизованные ионы металла. Соединение, добавленное в высокой концентрации, заменяет практически весь связанный с носителем белок, который таким образом элюируется из носителя. Имидазол является боковой цепью гистидина и обычно используется в концентрации 150 - 500 мМ для элюирования. Гистидин или гистамин также могут быть использованы.

При снижении pH остаток гистидина протонируется и больше не может координировать металлическую метку, позволяя белку элюироваться. Когда в качестве иона металла используется никель, он элюируется при pH около 4, а кобальт — при pH около 6.

При добавлении сильного хелатирующего агента, такого как ЭДТА, белок отделяется от носителя, поскольку ион металла, иммобилизованный на носителе, теряется.

Приложения

Очистка белка

Полигистидиновые метки часто используются для аффинной очистки полигистидиновых рекомбинантных белков, экспрессируемых в Escherichia coli или других системах экспрессии. Обычно клетки собирают центрифугированием , а полученный клеточный осадок лизируют либо физическими средствами, либо с помощью детергентов и ферментов, таких как лизоцим , или любой их комбинации. На этом этапе лизат содержит рекомбинантный белок среди многих эндогенных белков, происходящих из клеток-хозяев. Лизат подвергается воздействию аффинной смолы, связанной с матрицей-носителем, соединенной с двухвалентным катионом, либо путем прямого добавления смолы (связывание партии), либо путем пропускания через слой смолы в формате колонки. Затем смолу промывают буфером для удаления белков, которые специфически не взаимодействуют со связанным катионом, и интересующий белок элюируют со смолы с помощью буфера, содержащего высокую концентрацию имидазола или пониженный pH. Чистоту и количество белка можно оценить с помощью таких методов, как SDS-PAGE и вестерн-блоттинг . [14] [10] [15]

Аффинная очистка с использованием полигистидиновой метки обычно приводит к относительно чистому белку. Чистота белка может быть улучшена путем добавления низкой (20-40 мМ) концентрации имидазола к связывающим и/или промывочным буферам. Однако, в зависимости от требований последующего применения, могут потребоваться дополнительные этапы очистки с использованием таких методов, как ионообменная или гель -хроматография. Смолы IMAC обычно удерживают несколько важных эндогенных белков в качестве примесей. Например, в E. coli ярким примером является пептидилпролилизомераза типа FKBP, которая появляется около 25 кДа на SDS-PAGE . Эти примеси могут быть устранены с помощью дополнительных этапов очистки или путем экспрессии рекомбинантного белка в дефицитном штамме клеток. В качестве альтернативы можно использовать смолы IMAC, заряженные кобальтом, которые имеют меньшее сродство к эндогенным белкам. [16] [10] [14] [17]

Анализы связывания

Полигистидиновое мечение может использоваться для обнаружения белок-белковых взаимодействий таким же образом, как и метод pull-down . Полигистидиновое мечение имеет несколько преимуществ по сравнению с другими метками, обычно используемыми для pull-down-анализов, включая его небольшой размер, небольшое количество природных белков, связывающихся с матрицами-носителями, и повышенную стабильность матрицы-носителя по сравнению с матрицами моноклональных антител. [18]

Флуоресцентные метки

Были разработаны метки Hexahistadine CyDye, которые используют ковалентную координацию никеля с группами EDTA, прикрепленными к флуорофорам, чтобы создавать красители, которые присоединяются к полигистидиновой метке. Было показано, что эта техника полезна для отслеживания миграции и трафика белков и может быть эффективна для измерения расстояния посредством резонансного переноса энергии Фёрстера . [19]

Фторгистидиновые метки

Сообщалось об использовании полифторгистидиновой метки в системах трансляции in vitro . [20] В этой системе используется расширенный генетический код , в котором гистидин заменен на 4-фторгистидин. Фторированный аналог включается в пептиды через ослабленную субстратную специфичность гистидин-тРНК-лигазы и снижает общую pK a метки. Это позволяет избирательно обогащать пептиды, помеченные полифторгистидином, в присутствии сложных смесей традиционных полигистидиновых меток путем изменения pH промывочных буферов. [ необходима цитата ]

Обнаружение

Полигистидиновый тег также может быть использован для обнаружения белка с помощью антител к полигистидиновому тегу , что может быть полезно для субклеточной локализации , ИФА , вестерн-блоттинга и других иммуноаналитических методов. В качестве альтернативы, окрашивание в геле гелей SDS-PAGE или нативного PAGE с флуоресцентными зондами, содержащими ионы металлов, может быть использовано для обнаружения белка с полигистидиновым тегом. [21]

Похожие теги

тег HQ

Тег HQ содержит чередующиеся гистидин и глутамин (HQHQHQ).

тег HN

Тег HN имеет чередующиеся гистидин и аспарагин (HNHNHNHNHNHN) и с большей вероятностью будет представлен на поверхности белка, чем теги, состоящие только из гистидина. Тег HN связывается с иммобилизованным ионом металла более эффективно, чем тег His. [22]

тег HAT

Тег HAT представляет собой пептидный тег (KDHLIHNVHKEEHAHAHNK), полученный из куриной лактатдегидрогеназы , и, скорее всего, является растворимым белком без смещения в распределении заряда по сравнению с тегом His. [23] Расположение гистидинов в теге HAT обеспечивает высокую доступность по сравнению с тегом His, и он эффективно связывается с иммобилизованным ионом металла.

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Хочули Э., Баннварт В., Дёбели Х., Гентц Р., Штюбер Д. (1988). «Генетический подход к облегчению очистки рекомбинантных белков с помощью нового адсорбента хелатных металлов». Bio/Technology . 6 (11): 1321–5. doi :10.1038/nbt1188-1321. S2CID  9518666. INIST  7229670.
  2. ^ Использование тега для академических пользователей не ограничивалось; однако коммерческие пользователи должны были платить роялти Roche. Первоначальный патент истек 11 февраля 2003 года и теперь является общественной собственностью; текущие требования по роялти основаны на гораздо более узком наборе более поздних патентов. Подходящие последовательности тегов доступны бесплатно для коммерческого использования.
  3. ^ Porath J, Carlsson J, Olsson I, Belfrage G (декабрь 1975 г.). «Аффинная хроматография с металлическими хелатами, новый подход к фракционированию белков». Nature . 258 (5536): 598–599. Bibcode :1975Natur.258..598P. doi :10.1038/258598a0. PMID  1678. S2CID  4271836.
  4. ^ Porath J (август 1992). "Аффинная хроматография с иммобилизованными ионами металлов". Protein Expression and Purification . 3 (4): 263–281. doi :10.1016/1046-5928(92)90001-D. PMID  1422221.
  5. ^ "His-tag: The timeless standard for protein cleaning". Cube Biotech Knowledge Site . Архивировано из оригинала 2 декабря 2021 г. Получено 2 декабря 2021 г.{{cite web}}: CS1 maint: бот: исходный статус URL неизвестен ( ссылка )
  6. ^ ab Mohanty AK, Wiener MC (февраль 2004 г.). «Экспрессия и производство мембранного белка: эффекты длины и положения полигистидиновой метки». Protein Expression and Purification . 33 (2): 311–325. doi :10.1016/j.pep.2003.10.010. PMID  14711520.
  7. ^ Grisshammer R, Tucker J (октябрь 1997 г.). «Количественная оценка очистки рецепторов нейротензина методом аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом». Protein Expression and Purification . 11 (1): 53–60. doi :10.1006/prep.1997.0766. PMID  9325139.
  8. ^ ab Khan F, He M, Taussig MJ (май 2006 г.). «Двойная гексагистидиновая метка с высокой степенью связывания для иммобилизации, очистки и обнаружения белка на поверхностях нитрилотриуксусной кислоты». Аналитическая химия . 78 (9): 3072–3079. doi :10.1021/ac060184l. PMID  16642995.
  9. ^ ab Singh MI, Jain V (2013-05-15). «Маркировка экспрессируемого белка 6 гистидинами: быстрое клонирование ампликона с тремя вариантами». PLOS ONE . ​​8 (5): e63922. Bibcode :2013PLoSO...863922S. doi : 10.1371/journal.pone.0063922 . PMC 3655076 . PMID  23691118. 
  10. ^ abcdef Bornhorst JA, Falke JJ (2000-01-01). "Очистка белков с использованием полигистидиновых аффинных меток". Applications of Chimeric Genes and Hybrid Proteins Part A: Gene Expression and Protein Purification . Methods in Enzymology. Vol. 326. Academic Press. pp. 245–254. doi :10.1016/s0076-6879(00)26058-8. ISBN 978-0-12-182227-9. PMC  2909483 . PMID  11036646.
  11. ^ Hughes RA, Ellington AD (январь 2017 г.). «Синтетический синтез и сборка ДНК: внедрение синтетического в синтетическую биологию». Cold Spring Harbor Perspectives in Biology . 9 (1): a023812. doi :10.1101/cshperspect.a023812. PMC 5204324. PMID 28049645  . 
  12. ^ Paul DM, Beuron F, Sessions RB, Brancaccio A, Bigotti MG (февраль 2016 г.). «Внутреннее (His)₆-маркирование обеспечивает получение полностью функционального гетероолигомерного шаперонина класса II с высоким выходом». Scientific Reports . 6 (1): 20696. Bibcode :2016NatSR...620696P. doi :10.1038/srep20696. PMC 4746591 . PMID  26856373. 
  13. ^ Majorek KA, Kuhn ML, Chruszcz M, Anderson WF, Minor W (октябрь 2014 г.). «Двойная проблема — выбор буфера и присутствие His-тега могут быть ответственны за невоспроизводимость биомедицинских экспериментов». Protein Science . 23 (10): 1359–1368. doi :10.1002/pro.2520. PMC 4286991 . PMID  25044180. 
  14. ^ abcd Riguero V, Clifford R, Dawley M, Dickson M, Gastfriend B, Thompson C и др. (октябрь 2020 г.). «Оптимизация аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом для белков с полигистидиновыми метками». Журнал хроматографии A. 1629 : 461505. doi : 10.1016/j.chroma.2020.461505 . PMID  32861092. S2CID  221373404.
  15. ^ Hengen P (июль 1995). «Очистка белков слияния His-Tag из Escherichia coli». Trends in Biochemical Sciences . 20 (7): 285–286. doi :10.1016/S0968-0004(00)89045-3. PMID  7667882.
  16. ^ Chen X, Nomani A, Patel N, Hatefi A (июнь 2017 г.). «Производство низкоэкспрессирующих рекомбинантных катионных биополимеров с высокой чистотой». Protein Expression and Purification . 134 : 11–17. doi :10.1016/j.pep.2017.03.012. PMC 5479735. PMID  28315745 . 
  17. ^ Andersen KR, Leksa NC, Schwartz TU (ноябрь 2013 г.). «Оптимизированный штамм экспрессии E. coli LOBSTR устраняет распространенные загрязняющие вещества из очистки His-tag». Белки . 81 (11): 1857–1861. doi :10.1002/prot.24364. PMC 4086167 . PMID  23852738. 
  18. ^ Louche A, Salcedo SP, Bigot S (2017), Journet L, Cascales E (ред.), «Взаимодействие белков с белками: анализы с вытягиванием», Бактериальные системы секреции белков: методы и протоколы , Методы в молекулярной биологии, т. 1615, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Springer, стр. 247–255, doi : 10.1007/978-1-4939-7033-9_20, ISBN 978-1-4939-7033-9, PMID  28667618 , получено 2023-06-08
  19. ^ Zhao C, Hellman LM, Zhan X, Bowman WS, Whiteheart SW, Fried MG (апрель 2010 г.). «Оптические зонды, специфичные к гексагистидиновым меткам, для анализа белков и их взаимодействий». Аналитическая биохимия . 399 (2): 237–245. doi :10.1016/j.ab.2009.12.028. PMC 2832190. PMID  20036207 . 
  20. ^ Ring CM, Iqbal ES, Hacker DE, Hartman MC, Cropp TA (май 2017 г.). «Генетическое включение 4-фторгистидина в пептиды обеспечивает селективную аффинную очистку». Organic & Biomolecular Chemistry . 15 (21): 4536–4539. doi :10.1039/C7OB00844A. PMC 6010304 . PMID  28517015. 
  21. ^ Raducanu VS, Isaioglou I, Raducanu DV, Merzaban JS, Hamdan SM (август 2020 г.). «Упрощенное обнаружение полигистидин-меченых белков в гелях и мембранах с использованием УФ-возбуждаемого красителя и множественной пары хелаторов». Журнал биологической химии . 295 (34): 12214–12223. doi : 10.1074/jbc.ra120.014132 . PMC 7443479. PMID  32647010 . 
  22. ^ US 7176298, Tchaga GS, Jokhadze GG, «Полинуклеотиды, кодирующие пептиды, сродные к иону металла, и родственные продукты», выдан 13 февраля 2007 г., передан Takara Bio USA Inc. 
  23. ^ Чага Г, Бочкарев Д.Е., Джохадзе Г.Г., Хопп Дж., Нельсон П. (декабрь 1999 г.). «Природная полигистидиновая аффинная метка для очистки рекомбинантных белков на кобальт(II)-карбоксиметиласпартатной сшитой агарозе». Журнал хроматографии A. 864 ( 2): 247–256. doi :10.1016/S0021-9673(99)01008-0. PMID  10669292.

Внешние ссылки