stringtranslate.com

Репортерный ген

Схема использования репортерного гена для изучения регуляторной последовательности.

В молекулярной биологии ген- репортер (часто просто репортер ) — это ген , который исследователи присоединяют к регуляторной последовательности другого интересующего гена у бактерий , клеточных культур , животных или растений. Такие гены называются репортерами, потому что характеристики, которые они придают экспрессирующим их организмам, легко идентифицируются и измеряются, или потому, что они являются селектируемыми маркерами . Репортерные гены часто используются в качестве индикатора того, был ли определенный ген поглощен или экспрессирован в популяции клеток или организма.

Общие репортерные гены

Чтобы ввести репортерный ген в организм, ученые помещают репортерный ген и интересующий ген в одну и ту же конструкцию ДНК , которая будет вставлена ​​в клетку или организм. Для бактерий или прокариотических клеток в культуре это обычно имеет форму кольцевой молекулы ДНК, называемой плазмидой . Для вирусов это известно как вирусный вектор . Важно использовать репортерный ген, который не экспрессируется изначально в исследуемой клетке или организме, поскольку экспрессия репортера используется в качестве маркера успешного поглощения интересующего гена. [1]

Обычно используемые репортерные гены, которые вызывают визуально идентифицируемые характеристики, обычно включают флуоресцентные и люминесцентные белки. Примеры включают ген, который кодирует зеленый флуоресцентный белок медузы (GFP), который заставляет клетки , экспрессирующие его, светиться зеленым в синем или ультрафиолетовом свете, [2] фермент люциферазу , которая катализирует реакцию с люциферином для производства света, и красный флуоресцентный белок. белок из гена dsRed  [fr] . [3] [4] [5] [6] [7] Ген GUS широко используется в растениях, но люцифераза и GFP становятся все более распространенными. [8] [9]

Распространенным репортером у бактерий является ген lacZ E. coli , который кодирует белок бета-галактозидазу . [10] Этот фермент заставляет бактерии, экспрессирующие ген, выглядеть синими при выращивании на среде, содержащей аналог субстрата X-gal . Примером селектируемого маркера, который также является репортером у бактерий, является ген хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT), который придает устойчивость к антибиотику хлорамфениколу . [11]

Анализы трансформации и трансфекции

Многие методы трансфекции и трансформации – два способа экспрессии чужеродного или модифицированного гена в организме – эффективны лишь для небольшого процента населения, подвергнутого этим методам. [13] [14] Таким образом, необходим метод идентификации этих немногих успешных событий поглощения гена. Используемые таким образом репортерные гены обычно экспрессируются под своим собственным промотором (областями ДНК, которые инициируют транскрипцию гена), независимым от промотора введенного интересующего гена; ген-репортер может экспрессироваться конститутивно (то есть он «всегда включен») или индуцируемо с помощью внешнего вмешательства, такого как введение изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) в систему β-галактозидазы. [10] В результате экспрессия репортерного гена не зависит от экспрессии интересующего гена, что является преимуществом, когда интересующий ген экспрессируется только при определенных конкретных условиях или в тканях, к которым трудно получить доступ. [1]

В случае репортеров с селектируемыми маркерами, таких как CAT, трансфицированную популяцию бактерий можно выращивать на субстрате, содержащем хлорамфеникол . Только те клетки, которые успешно восприняли конструкцию, содержащую ген CAT, выживут и размножатся в этих условиях. [11]

Анализы экспрессии генов

Репортерные гены можно использовать для анализа экспрессии интересующего гена, который обычно трудно поддается количественному анализу. [1] Репортерные гены могут продуцировать белок, который оказывает незначительное или немедленное воздействие на культуру клеток или организм. В идеале они не присутствуют в нативном геноме, чтобы можно было изолировать экспрессию репортерного гена в результате экспрессии интересующего гена. [1] [15]

Чтобы активировать репортерные гены, их можно экспрессировать конститутивно , при этом они непосредственно прикрепляются к интересующему гену для создания слияния генов . [16] Этот метод является примером использования цис -действующих элементов, когда два гена находятся под одними и теми же промоторными элементами и транскрибируются в одну молекулу информационной РНК . Затем мРНК транслируется в белок . Важно, чтобы оба белка могли правильно сворачиваться в свои активные конформации и взаимодействовать со своими субстратами, несмотря на то, что они слиты. При построении конструкции ДНК обычно включается сегмент ДНК, кодирующий гибкую область полипептидного линкера, так что репортер и генный продукт лишь минимально мешают друг другу. [17] [18] Репортерные гены также могут экспрессироваться путем индукции во время роста. В этих случаях для экспрессии репортерного гена используются транс -действующие элементы, такие как факторы транскрипции . [19] [20]

Анализ репортерных генов все чаще используется в высокопроизводительном скрининге (HTS) для идентификации низкомолекулярных ингибиторов и активаторов белковых мишеней и путей для открытия лекарств и химической биологии . Поскольку сами репортерные ферменты (например, люцифераза светлячков ) могут быть прямыми мишенями для малых молекул и затруднять интерпретацию данных HTS, были разработаны новые конструкции репортеров совпадений, включающие подавление артефактов. [21] [22]

Промоторные анализы

Репортерные гены можно использовать для анализа активности конкретного промотора в клетке или организме. [23] В этом случае не существует отдельного «гена интереса»; репортерный ген просто помещают под контроль целевого промотора и количественно измеряют активность продукта репортерного гена. Результаты обычно сообщаются относительно активности под «консенсусным» промотором, который, как известно, индуцирует сильную экспрессию генов. [24]

Дальнейшее использование

Более сложное широкомасштабное использование репортерных генов заключается в двухгибридном скрининге , целью которого является идентификация белков, которые нативно взаимодействуют друг с другом in vivo . [25]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ abcd Дебнат, Моусуми; Прасад, Годаварти БКС; Бисен, Пракаш С. (2010), Дебнат, Моусуми; Прасад, Годаварти БКС; Бисен, Пракаш С. (ред.), «Ген-репортер», Молекулярная диагностика: обещания и возможности , Springer Нидерланды, стр. 71–84, doi : 10.1007/978-90-481-3261-4_5, ISBN 978-90-481-3261-4
  2. ^ ван Тор, Джаспер Дж.; Генш, Томас; Хеллингверф, Клаас Дж.; Джонсон, Луиза Н. (январь 2002 г.). «Фототрансформация зеленого флуоресцентного белка под действием УФ и видимого света приводит к декарбоксилированию глутамата 222». Структурная биология природы . 9 (1): 37–41. дои : 10.1038/nsb739. ISSN  1072-8368. ПМИД  11740505.
  3. ^ аб Соболески, Марк Р.; Оукс, Джейсон; Хэлфорд, Уильям П. (март 2005 г.). «Зеленый флуоресцентный белок является количественным репортером экспрессии генов в отдельных эукариотических клетках». Журнал ФАСЭБ . 19 (3): 440–442. doi : 10.1096/fj.04-3180fje . ISSN  0892-6638. ПМЦ 1242169 . ПМИД  15640280. 
  4. ^ аб Смейл, ST (01 мая 2010 г.). «Анализ люциферазы». Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2010 (5): pdb.prot5421. doi : 10.1101/pdb.prot5421. ISSN  1559-6095. ПМИД  20439408.
  5. ^ Ях, Гвидо; Бино, Эльке; Фрингс, Сабина; Люкса, Керстин; Шелл, Джефф (2001). «Использование красного флуоресцентного белка Discosoma sp. (dsRED) в качестве репортера экспрессии генов растений». Заводской журнал . 28 (4): 483–491. дои : 10.1046/j.1365-313X.2001.01153.x. ISSN  1365-313X. ПМИД  11737785.
  6. ^ Чжан, Цисян; Валаваге, Шрима Л.; Триколи, Дэвид М.; Дандекар, Абхая М.; Лесли, Чарльз А. (май 2015 г.). «Красный флуоресцентный белок (DsRED) из Discosoma sp. как репортер экспрессии генов в соматических эмбрионах грецкого ореха». Отчеты о растительных клетках . 34 (5): 861–869. дои : 10.1007/s00299-015-1749-1. ISSN  1432-203Х. PMID  25627255. S2CID  9184712.
  7. ^ Миккельсен, Лисбет; Саррокко, Сабрина; Любек, Метте; Дженсен, Дэн Фанк (1 июня 2003 г.). «Экспрессия красного флуоресцентного белка DsRed-Express в нитчатых аскомицетных грибах». Письма FEMS по микробиологии . 223 (1): 135–139. дои : 10.1016/S0378-1097(03)00355-0 . ISSN  0378-1097. ПМИД  12799012.
  8. ^ Халл, Джиллиан А.; Девич, Мартин (1995), Джонс, Хеддвин (редактор), «Система репортерных генов β-глюкуронидазы (Гас) Ген: слияния; спектрофотометрическое, флуорометрическое и гистохимическое обнаружение», Протоколы переноса и экспрессии генов растений , Методы молекулярной биологии , том. 49, Springer New York, стр. 125–141, doi : 10.1385/0-89603-321-x: 125, ISBN. 978-1-59259-536-5, PMID  8563799
  9. ^ Ку, Дж.; Ким, Ю.; Ким, Дж.; Йом, М.; Ли, IC; Нам, Х.Г. (2007). «Слитый репортер GUS/люциферазы для захвата растительных генов и анализа активности промотора с люциферин-зависимым контролем стабильности репортерного белка». Физиология растений и клеток . 48 (8): 1121–1131. дои : 10.1093/pcp/pcm081 . ПМИД  17597079.
  10. ^ abc Смейл, ST (01 мая 2010 г.). «Анализ -галактозидазы». Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2010 (5): pdb.prot5423. doi : 10.1101/pdb.prot5423. ISSN  1559-6095. ПМИД  20439410.
  11. ^ abc Смейл, ST (01 мая 2010 г.). «Анализ хлорамфениколацетилтрансферазы». Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2010 (5): pdb.prot5422. doi : 10.1101/pdb.prot5422. ISSN  1559-6095. ПМИД  20439409.
  12. ^ Нордгрен, ИК; Тавассоли, А (2014). «Двунаправленная флуоресцентная двухгибридная система для мониторинга белок-белковых взаимодействий». Молекулярные биосистемы . 10 (3): 485–90. дои : 10.1039/c3mb70438f . PMID  24382456. S2CID  12713372.
  13. ^ Ханахан, Дуглас; Джесси, Джоэл; Блум, Фредрик Р. (1991-01-01), «[4] Плазмидная трансформация Escherichia coli и других бактерий», Bacterial Genetic Systems , Methods in Enzymology, vol. 204, Academic Press, стр. 63–113, номер документа : 10.1016/0076-6879(91)04006-a, ISBN. 9780121821050, ПМИД  1943786
  14. ^ Ханахан, Дуглас (5 июня 1983). «Исследования по трансформации Escherichia coli плазмидами». Журнал молекулярной биологии . 166 (4): 557–580. CiteSeerX 10.1.1.460.2021 . дои : 10.1016/S0022-2836(83)80284-8. ISSN  0022-2836. ПМИД  6345791. 
  15. ↑ Архивировано в Ghostarchive и Wayback Machine: Promega Corporation, Promega Corporation (22 октября 2014 г.). «Введение в анализы репортерных генов». YouTube . Проверено 21 марта 2020 г.
  16. ^ де Йонг, Хидде; Гейзельманн, Йоханнес (2015). «Флуоресцентные репортерные гены и анализ бактериальных регуляторных сетей». В Малере, Одед; Халас, Адам; Данг, Тао; Пьяцца, Карла (ред.). Гибридная системная биология . Конспекты лекций по информатике. Том. 7699. Международное издательство Springer. стр. 27–50. дои : 10.1007/978-3-319-27656-4_2. ISBN 978-3-319-27656-4.
  17. ^ Спектор, Дэвид Л.; Голдман, Роберт Д. (1 декабря 2006 г.). «Конструирование и экспрессия слитых белков GFP». Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2006 (7): pdb.prot4649. doi : 10.1101/pdb.prot4649. ПМИД  22484672.
  18. ^ Чен, Сяоин; Заро, Дженника; Шен, Вэй-Чан (15 октября 2013 г.). «Линкеры слитых белков: свойства, дизайн и функциональность». Обзоры расширенной доставки лекарств . 65 (10): 1357–1369. doi :10.1016/j.addr.2012.09.039. ISSN  0169-409X. ПМЦ 3726540 . ПМИД  23026637. 
  19. ^ Ханко, Эрик КР; Минтон, Найджел П.; Малис, Наглис (01 января 2019 г.), «Глава девятая - Разработка, клонирование и характеристика систем индуцируемой экспрессии генов на основе транскрипционных факторов», в книге Шукла, Арун К. (редактор), « Подходы химической и синтетической биологии для понимания клеточных процессов». Функции. Часть А. Методы энзимологии. Том. 621, Academic Press, стр. 153–169, номер документа : 10.1016/bs.mie.2019.02.018, ISBN. 978-0-12-818117-1, PMID  31128776, S2CID  91744525 , получено 16 декабря 2019 г.
  20. ^ Каллунки, Туула; Баришич, Марин; Яэттеля, Марья; Лю, Бинь (30 июля 2019 г.). «Как выбрать правильную систему экспрессии индуцируемых генов для исследований на млекопитающих?». Клетки . 8 (8): 796. doi : 10.3390/cells8080796 . ISSN  2073-4409. ПМК 6721553 . ПМИД  31366153. 
  21. ^ Ченг, КЦ; Инглезе, Дж. (2012). «Система репортерного гена совпадений для высокопроизводительного скрининга». Природные методы . 9 (10): 937. doi :10.1038/nmeth.2170. ПМЦ 4970863 . ПМИД  23018994. 
  22. ^ Хассон, Ю.А.; Фогель, А.И.; Ван, К.; Макартур, Р.; Гуха, Р.; Хеман-Акач, С.; Мартин, С.; Юл, Р.Дж.; Инглезе, Дж. (2015). «Хемогеномное профилирование эндогенной экспрессии PARK2 с использованием репортера совпадений с отредактированным геномом». АКС хим. Биол . 10 (5): 1188–1197. дои : 10.1021/cb5010417. ПМЦ 9927027 . PMID  25689131. S2CID  20139739. 
  23. ^ Джагдер, Бат-Эрдэне; Уэлч, Джеффри; Брейди, Нэди; Маркиз, Кристофер П. (26 июля 2016 г.). «Создание и использование растворимого промотора гидрогеназы (PSH) Cupriavidus necatorH16, слитого с togfp (зеленый флуоресцентный белок)». ПерДж . 4 : е2269. дои : 10.7717/peerj.2269 . ISSN  2167-8359. ПМЦ 4974937 . ПМИД  27547572. 
  24. ^ Сольберг, Нина; Краусс, Стефан (2013). «Анализ люциферазы для изучения активности клонированного фрагмента ДНК-промотора». Генная регуляция . Методы молекулярной биологии. Том. 977. стр. 65–78. дои : 10.1007/978-1-62703-284-1_6. ISBN 978-1-62703-283-4. ISSN  1940-6029. ПМИД  23436354.
  25. ^ Брюкнер, Анна; Польж, Сесиль; Ленце, Николас; Ауэрбах, Даниэль; Шлаттнер, Уве (18 июня 2009 г.). «Двугибридные дрожжи, мощный инструмент системной биологии». Международный журнал молекулярных наук . 10 (6): 2763–2788. дои : 10.3390/ijms10062763 . ISSN  1422-0067. ПМК 2705515 . ПМИД  19582228. 

Внешние ссылки