Репликация по катящемуся кругу ( RCR ) – это процесс однонаправленной репликации нуклеиновой кислоты , который может быстро синтезировать множество копий кольцевых молекул ДНК или РНК , таких как плазмиды , геномы бактериофагов и геном кольцевой РНК вироидов . Некоторые эукариотические вирусы также реплицируют свою ДНК или РНК по механизму катящегося круга.
В качестве упрощенной версии естественной репликации по катящемуся кругу был разработан метод изотермической амплификации ДНК — амплификация по катящемуся кругу. Механизм RCA широко используется в молекулярной биологии и биомедицинских нанотехнологиях , особенно в области биосенсорства (как метод усиления сигнала). [1]
Репликация ДНК по катящемуся кругу инициируется белком-инициатором, кодируемым ДНК плазмиды или бактериофага, который разрывает одну цепь двухцепочечной кольцевой молекулы ДНК в месте, называемом двухцепочечным началом или DSO. Белок-инициатор остается связанным с 5'-фосфатным концом разорванной цепи, а свободный 3'-гидроксильный конец высвобождается и служит праймером для синтеза ДНК ДНК-полимеразой III . Используя неповрежденную цепь в качестве матрицы, репликация происходит вокруг кольцевой молекулы ДНК, замещая разорванную цепь одноцепочечной ДНК. Замещение разорванной цепи осуществляется кодируемой хозяином хеликазой, называемой PcrA (аббревиатура, обозначающая уменьшенную копию плазмиды) в присутствии белка инициации репликации плазмиды.
Продолжение синтеза ДНК может привести к образованию множества одноцепочечных линейных копий исходной ДНК в непрерывной серии от головы к хвосту, называемой конкатемером . Эти линейные копии могут быть преобразованы в двухцепочечные кольцевые молекулы с помощью следующего процесса:
Сначала белок-инициатор делает еще один разрыв в ДНК, чтобы прекратить синтез первой (ведущей) цепи. РНК-полимераза и ДНК-полимераза III затем реплицируют ДНК одноцепочечного происхождения (SSO), образуя еще один двухцепочечный круг. ДНК-полимераза I удаляет праймер, заменяя его ДНК, а ДНК-лигаза соединяет концы, образуя еще одну молекулу двухцепочечной кольцевой ДНК.
Подводя итог, можно сказать, что типичная репликация катящегося круга ДНК состоит из пяти этапов: [2]
Некоторые ДНК-вирусы реплицируют свою геномную информацию в клетках-хозяевах посредством репликации по катящемуся кругу. Например, вирус герпеса человека-6 (HHV-6)(hibv) экспрессирует набор «ранних генов», которые, как полагают, участвуют в этом процессе. [3] Полученные в результате длинные конкатемеры впоследствии расщепляются между областями pac-1 и pac-2 генома HHV-6 рибозимами, когда он упаковывается в отдельные вирионы. [4]
Вирус папилломы человека-16 (ВПЧ-16) — еще один вирус, который использует скользящую репликацию для быстрого производства потомства. ВПЧ-16 инфицирует эпителиальные клетки человека и имеет двухцепочечный кольцевой геном. Во время репликации в начале гексамер Е1 оборачивается вокруг одноцепочечной ДНК и движется в направлении от 3’ к 5’. При нормальной двунаправленной репликации два репликационных белка диссоциируются во время столкновения, но считается, что при ВПЧ-16 гексамер E1 не диссоциирует, что приводит к непрерывной катящейся репликации. Считается, что этот механизм репликации ВПЧ может иметь физиологическое значение для интеграции вируса в хромосому хозяина и возможного развития рака шейки матки. [5]
Кроме того, геминивирус также использует репликацию по катящемуся кругу в качестве механизма репликации. Этот вирус ответственен за уничтожение многих основных сельскохозяйственных культур, таких как маниока, хлопок, бобовые, кукуруза, томаты и бамия. Вирус имеет кольцевую одноцепочечную ДНК, которая реплицируется в клетках растения-хозяина. Весь процесс инициируется белком-инициатором репликации геминивируса Rep, который также отвечает за изменение среды хозяина, действуя как часть механизма репликации. Rep также поразительно похож на большинство других белков-инициаторов вращающейся репликации эубактерий с наличием мотивов I, II и III на N-конце. Во время репликации по катящемуся кругу оцДНК геминивируса преобразуется в дцДНК, а Rep затем присоединяется к дцДНК в исходной последовательности TAATATTAC. После того, как Rep вместе с другими белками репликации связывается с дцДНК, он образует стволовую петлю, в которой ДНК затем расщепляется по последовательности наномера, вызывая смещение цепи. Это смещение позволяет репликационной вилке двигаться в направлении от 3' к 5', что в конечном итоге дает новую цепь оцДНК и конкатамерную цепь ДНК. [6]
Промежуточные продукты репликации ДНК бактериофага Т4 включают кольцевые и разветвленные кольцевые конкатемерные структуры. [7] Эти структуры, вероятно, отражают механизм репликации по катящемуся кругу.
Некоторые РНК-вирусы и вироиды также реплицируют свой геном посредством репликации РНК по принципу катящегося круга. Для вироидов существует два альтернативных пути репликации РНК, которым следуют представители семейства Pospivirodae (асимметричная репликация) и Avsunviroidae (симметричная репликация) соответственно.
В семействе Pospiviroidae (PSTVd-подобные) кольцевая плюс-цепь РНК транскрибируется РНК-полимеразой хозяина в олигомерные минус-цепи, а затем в олигомерные плюс-цепи. [8] Эти олигомерные плюс-цепи расщепляются РНКазой хозяина и лигируются РНК-лигазой хозяина с образованием мономерной плюс-цепи кольцевой РНК. Это называется асимметричным путем репликации по катящемуся кругу. Вироиды семейства Avsunviroidae (ASBVd-подобные) реплицируют свой геном посредством симметричного пути репликации по катящемуся кругу. [9] В этом симметричном пути олигомерные минус-цепи сначала расщепляются и лигируются с образованием мономерных минус-цепей, а затем транскрибируются в олигомерные плюс-нити. Эти олигомерные плюс-цепи затем расщепляются и лигируются для образования мономерной плюс-цепи. Симметричный путь репликации получил свое название потому, что плюсовые и минусовые цепи образуются одинаково.
Расщепление олигомерных плюсовых и минусовых цепей опосредовано саморасщепляющейся структурой рибозима «головка молотка», присутствующей у Avsunviroidae, но такая структура отсутствует у Pospiviroidae. [10]
Производная форма репликации по катящемуся кругу успешно использовалась для амплификации ДНК из очень небольших количеств исходного материала. [1] Этот метод усиления называется усилением по вращающемуся кругу (RCA). В отличие от традиционных методов амплификации ДНК, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) , RCA представляет собой изотермический метод амплификации нуклеиновых кислот , при котором полимераза непрерывно добавляет отдельные нуклеотиды к праймеру, отожженному с кольцевой матрицей, что приводит к образованию длинной конкатемерной оцДНК, содержащей от десятков до сотен тандемных повторов (дополняющих круговой шаблон). [11]
Для проведения реакции RCA необходимы пять важных компонентов:
Полимеразами, используемыми в RCA, являются экзо- ДНК-полимераза Phi29 , Bst и Vent для амплификации ДНК и РНК-полимераза T7 для амплификации РНК. Поскольку ДНК-полимераза Phi29 обладает лучшей процессивностью и способностью к смещению цепи среди всех вышеупомянутых полимераз, ее чаще всего использовали в реакциях RCA. В отличие от полимеразной цепной реакции (ПЦР), RCA можно проводить при постоянной температуре (от комнатной температуры до 65°C) как в свободном растворе, так и поверх иммобилизованных мишеней (твердофазная амплификация).
Обычно реакция ДНК RCA состоит из трех этапов:
RCA производит линейную амплификацию ДНК, поскольку каждая кольцевая матрица растет с заданной скоростью в течение определенного периода времени. Чтобы увеличить выход и добиться экспоненциальной амплификации, как это делает ПЦР, было исследовано несколько подходов. Одним из них является амплификация по сверхразветвленному катящемуся кругу или HRCA, при которой добавляются и удлиняются праймеры, которые отжигаются с исходными продуктами RCA. [12] Таким образом, исходный RCA создает больше шаблонов, которые можно усилить. Другой вариант - амплификация по кругу или C2CA, где продукты RCA расщепляются ферментом рестрикции и лигируются в новые кольцевые матрицы с использованием рестрикционного олигонуклеотида, после чего следует новый раунд RCA с большим количеством кольцевых матриц для амплификации. [13]
RCA может усиливать одно событие молекулярного связывания более чем в тысячу раз, что делает его особенно полезным для обнаружения целей со сверхнизким содержанием. Реакции RCA можно проводить не только в среде свободного раствора, но также на твердой поверхности, такой как стекло, микро- или наношарики, планшеты с микролунками, микрофлюидные устройства или даже бумажные полоски. Эта особенность делает его очень мощным инструментом для усиления сигналов в твердофазных иммуноанализах (например, ELISA ). Таким образом, RCA становится универсальным инструментом усиления сигнала с широким спектром применений в геномике, протеомике, диагностике и биосенсорстве.
Immuno-RCA — это изотермический метод усиления сигнала для высокоспецифичного и высокочувствительного обнаружения и количественного определения белков. Этот метод объединяет две области: RCA, который позволяет амплифицировать нуклеотиды, и иммуноанализ, в котором используются антитела, специфичные к внутриклеточным или свободным биомаркерам. В результате иммуно-RCA дает специфический усиленный сигнал (высокое соотношение сигнал/шум), что делает его пригодным для обнаружения, количественного определения и визуализации белковых маркеров с низким содержанием в жидкофазных иммуноанализах [14] [15] [16] и иммуногистохимия .
Иммуно-RCA следует за типичной иммуноадсорбентной реакцией при ELISA или иммуногистохимическом окрашивании тканей. [17] Детектирующие антитела, используемые в реакции иммуно-RCA, модифицируются путем присоединения олигонуклеотида оцДНК к концу тяжелых цепей. Таким образом, участок Fab (фрагмент, связывание антигена) детектирующего антитела все еще может связываться со специфическими антигенами, а олигонуклеотид может служить праймером для реакции RCA.
Типичная процедура иммуно-RCA, опосредованная антителами, выглядит следующим образом:
1. Детектирующее антитело распознает конкретную белковую мишень. Это антитело также прикреплено к олигонуклеотидному праймеру.
2. Если присутствует кольцевая ДНК, ее отжигают, и праймер соответствует комплементарной последовательности кольцевой ДНК.
3. Комплементарная последовательность кольцевой ДНК-матрицы копируется сотни раз и остается прикрепленной к антителу.
4. Выход RCA (удлиненная оцДНК) обнаруживается с помощью флуоресцентных зондов с использованием флуоресцентного микроскопа или устройства для считывания микропланшетов.
В дополнение к иммуно-RCA, опосредованному антителами, праймер RCA оцДНК также может быть конъюгирован с 3'-концом аптамера ДНК. Хвост праймера можно амплифицировать посредством амплификации по катящемуся кругу. Продукт можно визуализировать посредством маркировки флуоресцентного репортера. [19] Этот процесс показан на рисунке справа.
Различные производные RCA широко использовались в области биосенсорства. Например, RCA успешно используется для обнаружения наличия вирусной и бактериальной ДНК в клинических образцах, [20] [21] , что очень полезно для быстрой диагностики инфекционных заболеваний . Он также использовался в качестве метода усиления сигнала на чипе для анализа нуклеиновых кислот (как для ДНК, так и для РНК) на микрочипах . [1]
Помимо функции амплификации в биосенсорных приложениях, метод RCA также может применяться для создания наноструктур ДНК и гидрогелей ДНК. Продукты RCA также можно использовать в качестве темплатов для периодической сборки наночастиц или белков, синтеза металлических нанопроволок [22] и формирования наноостровков. [1]