Сайт-специфическая рекомбинация , также известная как консервативная сайт-специфическая рекомбинация , является типом генетической рекомбинации , при которой обмен цепями ДНК происходит между сегментами, обладающими по крайней мере определенной степенью гомологии последовательностей . [1] [2] [3] Ферменты, известные как сайт-специфические рекомбиназы (SSR), выполняют перестройки сегментов ДНК, распознавая и связываясь с короткими, специфическими последовательностями ДНК (сайтами), в которых они расщепляют остов ДНК, обмениваются двумя вовлеченными спиралями ДНК и воссоединяют цепи ДНК. В некоторых случаях наличие фермента рекомбиназы и сайтов рекомбинации достаточно для протекания реакции; в других системах требуется ряд дополнительных белков и/или дополнительных сайтов. Многие различные стратегии модификации генома , среди которых обмен кассетами, опосредованный рекомбиназой (RMCE), передовой подход для целенаправленного введения единиц транскрипции в предопределенные геномные локусы, основаны на SSR.
Системы сайт-специфической рекомбинации являются высокоспецифичными, быстрыми и эффективными, даже при столкновении со сложными эукариотическими геномами. [4] Они используются естественным образом в различных клеточных процессах, включая репликацию бактериального генома , дифференциацию и патогенез , а также перемещение мобильных генетических элементов . [5] По тем же причинам они представляют собой потенциальную основу для разработки инструментов генной инженерии . [6]
Сайты рекомбинации обычно имеют длину от 30 до 200 нуклеотидов и состоят из двух мотивов с частичной инвертированной повторной симметрией, с которыми связывается рекомбиназа, и которые фланкируют центральную кроссоверную последовательность, в которой происходит рекомбинация. Пары сайтов, между которыми происходит рекомбинация, обычно идентичны, но есть исключения (например, attP и attB λ-интегразы ). [7]
На основе гомологии аминокислотных последовательностей и механистического родства большинство сайт-специфических рекомбиназ группируются в одно из двух семейств: семейство тирозиновых (Tyr) рекомбиназ или семейство сериновых (Ser) рекомбиназ . Названия происходят от консервативного нуклеофильного аминокислотного остатка, присутствующего в каждом классе рекомбиназ, который используется для атаки ДНК и который становится ковалентно связанным с ней во время обмена цепями. Самые ранние идентифицированные члены семейства сериновых рекомбиназ были известны как резолвазы или ДНК-инвертазы, в то время как основатель тирозиновых рекомбиназ, интеграза фага лямбда (использующая сайты распознавания attP/B), отличается от ныне хорошо известных ферментов, таких как Cre (из фага P1 ) и FLP (из дрожжей Saccharomyces cerevisiae ). Известные сериновые рекомбиназы включают такие ферменты, как гамма-дельта-резольваза (из транспозона Tn 1000 ), Tn3-резольваза (из транспозона Tn3) и φ C31-интеграза (из фага φ C31). [8] Существует несколько классов сериновых рекомбиназ, состоящих из малой сериновой рекомбиназы, резолвазы ISXc5, сериновой транспозазы и большой сериновой рекомбиназы. [9]
Хотя отдельные члены двух семейств рекомбиназ могут выполнять реакции с одинаковыми практическими результатами, эти семейства не связаны друг с другом, имея разные структуры белков и механизмы реакций. В отличие от тирозиновых рекомбиназ, сериновые рекомбиназы являются высокомодульными, на что впервые намекнули биохимические исследования [10] и позднее показали кристаллографические структуры. [11] [12] Знание этих структур белков может оказаться полезным при попытке реинжиниринга рекомбиназных белков в качестве инструментов для генетических манипуляций.
Рекомбинация между двумя участками ДНК начинается с распознавания и связывания этих участков — одного участка на каждой из двух отдельных двухцепочечных молекул ДНК или, по крайней мере, двух отдаленных сегментов одной и той же молекулы — ферментом рекомбиназой. Затем следует синапсис , т. е. объединение участков для формирования синаптического комплекса. Именно внутри этого синаптического комплекса происходит обмен цепями, поскольку ДНК расщепляется и воссоединяется контролируемыми реакциями переэтерификации . Во время обмена цепями каждая двухцепочечная молекула ДНК разрезается в фиксированной точке в области кроссовера участка распознавания, высвобождая гидроксильную группу дезоксирибозы , в то время как фермент рекомбиназа образует временную ковалентную связь с фосфатом остова ДНК . Эта фосфодиэфирная связь между гидроксильной группой нуклеофильного остатка серина или тирозина сохраняет энергию, которая была затрачена на расщепление ДНК. Энергия, запасенная в этой связи, впоследствии используется для повторного присоединения ДНК к соответствующей гидроксильной группе дезоксирибозы на другой молекуле ДНК. Таким образом, вся реакция протекает без необходимости во внешних богатых энергией кофакторах, таких как АТФ .
Хотя основная химическая реакция одинакова для тирозиновых и сериновых рекомбиназ, между ними есть некоторые различия. [13] Тирозиновые рекомбиназы, такие как Cre или FLP , расщепляют одну цепь ДНК за раз в точках, которые смещены на 6–8 пар оснований, связывая 3'-конец цепи с гидроксильной группой нуклеофила тирозина (рис. 1). [14] Затем обмен цепями происходит через промежуточное соединение скрещенных цепей, аналогичное соединению Холлидея , в котором обменивается только одна пара цепей. [15] [16]
Механизм и контроль сериновых рекомбиназ изучены гораздо меньше. Эта группа ферментов была открыта только в середине 1990-х годов и все еще относительно мала. Теперь уже классические члены гамма-дельта и Tn3 резольваза , а также новые дополнения, такие как φC31-, Bxb1- и R4 интегразы, разрезают все четыре цепи ДНК одновременно в точках, которые смещены на 2 п.н. (рис. 2). [17] Во время расщепления связь белок-ДНК образуется посредством реакции трансэтерификации , в которой фосфодиэфирная связь заменяется фосфосериновой связью между 5'-фосфатом в месте расщепления и гидроксильной группой консервативного остатка серина (S10 в резольвазе). [18] [19]
До сих пор не совсем ясно, как происходит обмен цепями после расщепления ДНК. Однако было показано, что цепи обмениваются, будучи ковалентно связанными с белком, с результирующим чистым вращением на 180°. [20] [21] Наиболее цитируемая (но не единственная) модель, объясняющая эти факты, — это «модель вращения субъединиц» (рис. 2). [13] [22] Независимо от модели, дуплексы ДНК расположены вне белкового комплекса, и для достижения обмена цепями требуется большое перемещение белка. В этом случае сайты рекомбинации слегка асимметричны, что позволяет ферменту различать левый и правый концы сайта. При генерации продуктов левые концы всегда соединяются с правыми концами своих сайтов-партнеров, и наоборот. Это приводит к тому, что в продуктах рекомбинации восстанавливаются различные гибридные сайты рекомбинации. Соединение левых концов с левым или правых с правыми избегается благодаря асимметричной последовательности «перекрытия» между смещенными точками обмена верхней и нижней цепями, что резко контрастирует с механизмом, используемым тирозиновыми рекомбиназами. [13]
Например, реакция, катализируемая Cre-рекомбиназой, может привести к вырезанию сегмента ДНК, фланкированного двумя сайтами (рис. 3A), но может также привести к интеграции или инверсии ориентации фланкированного сегмента ДНК (рис. 3B). Каким будет результат реакции, в основном определяется относительным расположением и ориентацией сайтов, которые должны быть рекомбинированы, но также и врожденной специфичностью рассматриваемой сайт-специфической системы. Вырезания и инверсии происходят, если рекомбинация происходит между двумя сайтами, которые находятся на одной и той же молекуле (внутримолекулярная рекомбинация), и если сайты находятся в одной и той же (прямой повтор) или в противоположной ориентации (инвертированный повтор) соответственно. Вставки, с другой стороны, происходят, если рекомбинация происходит на сайтах, которые расположены на двух разных молекулах ДНК (межмолекулярная рекомбинация), при условии, что по крайней мере одна из этих молекул является кольцевой. Большинство сайт-специфических систем являются узкоспециализированными, катализируют только один из этих различных типов реакций и эволюционировали так, чтобы игнорировать сайты, которые находятся в «неправильной» ориентации.