Чувствительный к напряжению краситель

Потенциометрические красители , также известные как красители , которые изменяют свои спектральные свойства в ответ на изменения напряжения . ^[1] Они способны обеспечить линейные измерения активности импульсации отдельных нейронов , больших нейронных популяций или активности миоцитов . Многие физиологические процессы сопровождаются изменениями потенциала клеточной мембраны , которые можно обнаружить с помощью красителей, чувствительных к напряжению. Измерения могут указывать на место возникновения потенциала действия , а также могут быть получены измерения скорости и направления потенциала действия. ^[2]

Потенциометрические красители используются для мониторинга электрической активности внутри клеточных органелл, куда невозможно вставить электрод , например, митохондрии и дендритные шипики . Эта технология особенно эффективна для изучения закономерностей активности в сложных многоклеточных препаратах. Она также позволяет измерять пространственные и временные изменения мембранного потенциала вдоль поверхности отдельных клеток.

Виды красителей

Пионеры в области красителей, чувствительных к напряжению: А. Гринвальд, Л. Б. Коэн, К. Камино, Б. М. Зальцберг, В. Н. Росс; Токио, 2000 г.

Быстродействующие зонды: это амфифильные красители для окрашивания мембран, которые обычно имеют пару углеводородных цепей, действующих как мембранные якоря, и гидрофильную группу, которая выравнивает хромофор перпендикулярно мембранно-водному интерфейсу. Считается, что хромофор претерпевает большой сдвиг электронного заряда в результате возбуждения из основного в возбужденное состояние , и это лежит в основе предполагаемого электрохромного механизма чувствительности этих красителей к мембранному потенциалу. Эта молекула (краситель) интеркалирует среди липофильной части биологических мембран . Такая ориентация гарантирует, что перераспределение заряда, вызванное возбуждением, будет происходить параллельно электрическому полю внутри мембраны. Следовательно, изменение напряжения на мембране вызовет спектральный сдвиг в результате прямого взаимодействия между полем и дипольными моментами основного и возбужденного состояний .

Новые красители напряжения могут определять напряжение с высокой скоростью и чувствительностью, используя фотоиндуцированный перенос электронов (PeT) через сопряженный молекулярный провод. ^{[3] [4]}

Зонды с медленным откликом: они демонстрируют потенциал-зависимые изменения в своем трансмембранном распределении, которые сопровождаются изменением флуоресценции. Типичные зонды с медленным откликом включают катионные карбоцианины и родамины , а также ионные оксонолы.

Примеры

Обычно используемые красители, чувствительные к напряжению, представляют собой замещенные аминонафтилэтенилпиридиновые (ANEP) красители, такие как di-4-ANEPPS, di-8-ANEPPS и RH237. В зависимости от их химических модификаций, которые изменяют их физические свойства, они используются для различных экспериментальных процедур. ^[5] Они были впервые описаны в 1985 году исследовательской группой Лесли Лоу. ^[6] ANNINE-6plus — это краситель, чувствительный к напряжению, с быстрым откликом ( время отклика нс ) и высокой чувствительностью. Он был применен для измерения потенциалов действия одной t-трубочки кардиомиоцитов Гиксюэ Бу и др. ^[7] Совсем недавно была представлена ​​серия фторированных красителей ANEP, которые обеспечивают повышенную чувствительность и фотостабильность; они также доступны в широком диапазоне длин волн возбуждения и испускания. ^[8] Недавнее вычислительное исследование подтвердило, что красители ANEP подвержены влиянию только электростатической среды, а не специфических молекулярных взаимодействий. ^[9] Другие структурные каркасы, такие как ксантены, ^[10] также успешно используются.

Материалы

Основным материалом для визуализации активности мозга с помощью красителей, чувствительных к напряжению, являются сами красители. Эти красители, чувствительные к напряжению, липофильны и предпочтительно локализуются в мембранах с их гидрофобными хвостами. Они используются в приложениях, связанных с флуоресценцией или поглощением; они быстро действуют и способны обеспечивать линейные измерения изменений мембранного потенциала. ^[11] Красители, чувствительные к напряжению, поставляются многими компаниями, которые предлагают флуоресцентные зонды для биологических приложений. Potentiometric Probes, LLC специализируется только на красителях, чувствительных к напряжению; у них есть эксклюзивная лицензия на распространение большого набора фторированных VSD, продаваемых под брендом ElectroFluor.

Разнообразное специализированное оборудование может использоваться в сочетании с красителями, и выбор оборудования будет варьироваться в зависимости от особенностей препарата. По сути, оборудование будет включать специализированные микроскопы и устройства визуализации, а также может включать технические лампы или лазеры. ^[11]

Сильные и слабые стороны

Преимущества визуализации активности мозга с помощью чувствительных к напряжению красителей включают в себя следующие возможности:

• Измерение сигналов популяции из многих областей может быть выполнено одновременно, и сотни нейронов могут быть зарегистрированы. Такие многосайтовые записи могут предоставить точную информацию о начале и распространении потенциала действия (включая направление и скорость), а также о всей структуре ветвления нейрона. ^[11]
• Можно провести измерения активности спайков в ганглии, который формирует поведение, и получить информацию о том, как формируется поведение. ^[11]
• В некоторых препаратах фармакологические эффекты красителей можно полностью обратить, удалив красящую пипетку и дав нейрону 1–2 часа на восстановление. ^[11]
• Красители могут быть использованы для анализа интеграции сигнала в терминальных дендритных ветвях. Чувствительные к напряжению красители предлагают единственную альтернативу генетически кодируемым чувствительным к напряжению белкам (таким как белки, полученные из Ci-VSP) для этого. ^[11]
• Более растворимые красители, такие как ElectroFluor-530s или di-2-ANEPEQ, могут быть перфузированы внутрь отдельной клетки через пипетку. Эта техника позволила изучать электрические сигналы в отдельных дендритах ^{[12] [13]} и дендритных шипиках ^{[14] [15] [16] [17]} в срезах мозга.

К недостаткам визуализации активности мозга с помощью чувствительных к напряжению красителей относятся следующие проблемы:

• Чувствительные к напряжению красители могут реагировать по-разному в зависимости от препарата; обычно для получения оптимального сигнала необходимо протестировать десятки красителей. ^[11] Параметры визуализации, такие как длина волны возбуждения, длина волны излучения, время экспозиции, также должны быть оптимизированы.
• Чувствительные к напряжению красители часто не могут проникнуть через соединительную ткань или перемещаться через внутриклеточные пространства к области мембраны, желаемой для исследования. ^[11] Окрашивание является серьезной проблемой при применении этих красителей. Водорастворимые красители, такие как ANNINE-6plus , ElectroFluor-530s или di-2-ANEPEQ, не страдают от этой проблемы.
• С другой стороны, если красители слишком растворимы в воде, окрашивание может не сохраняться. Это можно решить, используя красители, содержащие более длинные алкильные цепи для повышения липофильности.
• Шум является проблемой во всех препаратах с чувствительными к напряжению красителями, а в некоторых препаратах сигнал может быть значительно затемнен. ^[11] Соотношение сигнал/шум можно улучшить с помощью алгоритмов пространственной фильтрации или временной фильтрации. Существует много таких алгоритмов; один алгоритм обработки сигнала можно найти в недавней работе с красителем ANNINE-6plus. ^[7]
• Клетки могут быть постоянно затронуты лечением. Возможны длительные фармакологические эффекты, а фотодинамика красителей может быть разрушительной. ^[11] Недавно разработанные фторированные красители, чувствительные к напряжению, показали, что они смягчают эти эффекты. ^{[8] [18]}

Использует

Чувствительные к напряжению красители использовались для измерения нейронной активности в нескольких областях нервной системы у различных организмов, включая гигантский аксон кальмара , ^[19] вибриссные стволы соматосенсорной коры крысы, ^{[20] [21]} обонятельную луковицу саламандры, ^{[22] [23] [24]} зрительную кору кошки, ^[25] зрительный покров лягушки, ^[26] и зрительную кору резус- макаки . ^{[27] [28]}

Было опубликовано множество приложений в области электрофизиологии сердца, включая ex vivo картирование электрической активности целых сердец у различных видов животных, ^{[29] [30],} субклеточную визуализацию отдельных кардиомиоцитов, ^[31] и даже картирование синусовых ритмов и аритмий на открытом сердце свиньи in vivo , ^[18] , где артефакты движения можно было устранить с помощью визуализации с двойным соотношением длин волн флуоресценции красителя, чувствительного к напряжению.

Ссылки

1. Khadria A (ноябрь 2012 г.). «Инструменты для измерения мембранного потенциала нейронов». Biomedical Journal . 45 (5): 749–762. doi :10.1016/j.bj.2022.05.007. PMC 9661650.  PMID 35667642.  S2CID 249354518  .
2. Cohen LB, Salzberg BM (1978). "Оптическое измерение мембранного потенциала". Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology . 83 : 35–88. doi :10.1007/3-540-08907-1_2. ISBN 978-3-540-08907-0. PMID  360357.
3. Woodford CR, Frady EP, Smith RS, Morey B, Canzi G, Palida SF и др. (февраль 2015 г.). «Улучшенные молекулы PeT для оптического измерения напряжения в нейронах». Журнал Американского химического общества . 137 (5): 1817–1824. doi :10.1021/ja510602z. PMC 4513930. PMID  25584688 . 
4. Sirbu D, Butcher JB, Waddell PG, Andras P, Benniston AC (октябрь 2017 г.). "Локально возбужденные состояния-перенос заряда красители, связанные с состоянием, как оптически чувствительные зонды нейронной активации" (PDF) . Chemistry: A European Journal . 23 (58): 14639–14649. doi :10.1002/chem.201703366. PMID  28833695.
5. "Потенциально-чувствительные красители ANEP" (PDF) . Invitrogen . 24 марта 2006 г.
6. Fluhler E, Burnham VG, Loew LM (октябрь 1985 г.). «Спектры, связывание с мембраной и потенциометрические ответы новых зондов сдвига заряда». Биохимия . 24 (21): 5749–5755. doi :10.1021/bi00342a010. PMID  4084490.
7. Bu G, Adams H, Berbari EJ, Rubart M (март 2009 г.). «Равномерная реполяризация потенциала действия в сарколемме желудочковых кардиомиоцитов in situ». Biophysical Journal . 96 (6): 2532–2546. Bibcode :2009BpJ....96.2532B. doi :10.1016/j.bpj.2008.12.3896. PMC 2907679 . PMID  19289075. 
8. Yan P, Acker CD, Zhou WL, Lee P, Bollensdorff C, Negrean A и др. (декабрь 2012 г.). «Палитра фторированных чувствительных к напряжению гемицианиновых красителей». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 109 (50): 20443–20448. Bibcode : 2012PNAS..10920443Y. doi : 10.1073/pnas.1214850109 . PMC 3528613. PMID  23169660 . 
9. Робинсон Д., Бесли Н. А., О'Ши П., Херст Дж. Д. (апрель 2011 г.). «Спектры испускания Di-8-ANEPPS в фосфолипидных/холестериновых мембранах: теоретическое исследование». Журнал физической химии B. 115 ( 14): 4160–4167. doi :10.1021/jp1111372. PMID  21425824.
10. Фиала, Томас; Ван, Джихан; Данн, Мэтью; Шебей, Питер; Чой, Се Джун; Нвадибия, Экеома К.; Фиалова, Ева; Мартинес, Диана М.; Читам, Клэр Э.; Фогл, Кери Дж.; Палладино, Майкл Дж.; Фрейберг, Захари; Сульцер, Дэвид; Сеймс, Далибор (2020-05-20). «Химическое нацеливание чувствительных к напряжению красителей на определенные клетки и молекулы в мозге». Журнал Американского химического общества . 142 (20): 9285–9301. doi :10.1021/jacs.0c00861. ISSN  0002-7863. PMC 7750015. PMID 32395989  . 
11. Baker BJ, Kosmidis EK, Vucinic D, Falk CX, Cohen LB, Djurisic M, Zecevic D (март 2005 г.). «Визуализация активности мозга с помощью красителей, чувствительных к напряжению и кальцию». Cellular and Molecular Neurobiology . 25 (2): 245–282. doi :10.1007/s10571-005-3059-6. PMID  16050036. S2CID  1751986.
12. Zecević D (май 1996). «Множественные зоны инициации спайков в отдельных нейронах, выявленные с помощью чувствительных к напряжению красителей». Nature . 381 (6580): 322–325. Bibcode :1996Natur.381..322Z. doi :10.1038/381322a0. PMID  8692270. S2CID  4322430.
13. Zhou WL, Yan P, Wuskell JP, Loew LM, Antic SD (февраль 2008 г.). «Динамика обратного распространения потенциала действия в базальных дендритах пирамидальных нейронов префронтальной коры». The European Journal of Neuroscience . 27 (4): 923–936. doi :10.1111/j.1460-9568.2008.06075.x. PMC 2715167 . PMID  18279369. 
14. Palmer LM, Stuart GJ (май 2009). «Изменения мембранного потенциала в дендритных шипиках во время потенциалов действия и синаптического входа». The Journal of Neuroscience . 29 (21): 6897–6903. doi :10.1523/JNEUROSCI.5847-08.2009. PMC 6665597. PMID  19474316 . 
15. Acker CD, Yan P, Loew LM (июль 2011 г.). «Одновоксельная запись переходных процессов напряжения в дендритных шипиках». Biophysical Journal . 101 (2): L11–L13. Bibcode :2011BpJ...101L..11A. doi : 10.1016/j.bpj.2011.06.021 . PMC 3136788 . PMID  21767473. 
16. Acker CD, Hoyos E, Loew LM (март 2016 г.). «EPSP, измеренные в проксимальных дендритных шипиках корковых пирамидных нейронов». eNeuro . 3 (2): ENEURO.0050–15.2016. doi :10.1523/ENEURO.0050-15.2016. PMC 4874537 . PMID  27257618. 
17. Popovic MA, Carnevale N, Rozsa B, Zecevic D (октябрь 2015 г.). "Электрическое поведение дендритных шипиков, выявленное с помощью визуализации напряжения". Nature Communications . 6 (1): 8436. Bibcode :2015NatCo...6.8436P. doi :10.1038/ncomms9436. PMC 4594633 . PMID  26436431. 
18. Ли П., Кинтанилья Х.Г., Альфонсо-Альмазан Х.М., Галан-Арриола С., Ян П., Санчес-Гонсалес Дж. и др. (сентябрь 2019 г.). «Ратионометрическое оптическое картирование in vivo позволяет проводить электрофизиологию сердца с высоким разрешением на моделях свиней». Сердечно-сосудистые исследования . 115 (11): 1659–1671. дои : 10.1093/cvr/cvz039. ПМК 6704389 . ПМИД  30753358. 
19. Гринвальд А., Хильдесхайм Р. (ноябрь 2004 г.). «VSDI: новая эра в функциональной визуализации динамики коры». Nature Reviews. Neuroscience . 5 (11): 874–885. doi :10.1038/nrn1536. PMID  15496865. S2CID  205500046.
20. Petersen CC, Grinvald A, Sakmann B (февраль 2003 г.). «Пространственно-временная динамика сенсорных реакций в слое 2/3 баррельной коры крысы, измеренная in vivo с помощью чувствительной к напряжению визуализации красителя в сочетании с записями напряжения всей клетки и реконструкциями нейронов». Журнал нейронауки . 23 (4): 1298–1309. doi : 10.1523/JNEUROSCI.23-04-01298.2003 . PMC 6742278. PMID  12598618 . 
21. Petersen CC, Sakmann B (ноябрь 2001 г.). «Функционально независимые столбцы соматосенсорной бочкообразной коры крысы, выявленные с помощью визуализации с помощью чувствительного к напряжению красителя». The Journal of Neuroscience . 21 (21): 8435–8446. doi : 10.1523/JNEUROSCI.21-21-08435.2001 . PMC 6762780 . PMID  11606632. 
22. Cinelli AR, Hamilton KA, Kauer JS (май 1995). «Активность нейронов обонятельной луковицы саламандры, наблюдаемая с помощью видеоскорости, визуализации красителя, чувствительного к напряжению. III. Пространственные и временные свойства ответов, вызванных стимуляцией одорантом». Журнал нейрофизиологии . 73 (5): 2053–2071. doi :10.1152/jn.1995.73.5.2053. PMID  7542699.
23. Cinelli AR, Kauer JS (май 1995). «Активность нейронов обонятельной луковицы саламандры, наблюдаемая с помощью видеоскорости, визуализации красителя, чувствительного к напряжению. II. Пространственные и временные свойства ответов, вызванных электрической стимуляцией». Журнал нейрофизиологии . 73 (5): 2033–2052. doi :10.1152/jn.1995.73.5.2033. PMID  7623098.
24. Cinelli AR, Neff SR, Kauer JS (май 1995). «Активность нейронов обонятельной луковицы саламандры, наблюдаемая с помощью видеоскорости, визуализации с использованием красителя, чувствительного к напряжению. I. Характеристика системы регистрации». Журнал нейрофизиологии . 73 (5): 2017–2032. doi :10.1152/jn.1995.73.5.2017. PMID  7542698.
25. Ариели А, Стеркин А, Гринвальд А, Аэртсен А (сентябрь 1996 г.). «Динамика текущей активности: объяснение большой изменчивости вызванных корковых ответов». Science . 273 (5283): 1868–1871. Bibcode :1996Sci...273.1868A. doi :10.1126/science.273.5283.1868. PMID  8791593. S2CID  23741402.
26. Гринвальд А., Энглистер Л., Фримен JA, Хильдесхайм Р., Манкер А. (1984). «Оптическая визуализация естественно вызванной электрической активности в интактном мозге лягушки в реальном времени». Nature . 308 (5962): 848–850. Bibcode :1984Natur.308..848G. doi :10.1038/308848a0. PMID  6717577. S2CID  4369241.
27. Словин Х., Ариели А., Хильдесхайм Р., Гринвальд А. (декабрь 2002 г.). «Длительная визуализация с помощью чувствительного к напряжению красителя выявляет кортикальную динамику у ведущих себя обезьян». Журнал нейрофизиологии . 88 (6): 3421–3438. doi :10.1152/jn.00194.2002. PMID  12466458.
28. Seidemann E, Arieli A, Grinvald A, Slovin H (февраль 2002 г.). «Динамика деполяризации и гиперполяризации во фронтальной коре и цель саккады». Science . 295 (5556): 862–865. Bibcode :2002Sci...295..862S. CiteSeerX 10.1.1.386.4910 . doi :10.1126/science.1066641. PMID  11823644. S2CID  555180. 
29. Matiukas A, Mitrea BG, Qin M, Pertsov AM, Shvedko AG, Warren MD и др. (ноябрь 2007 г.). «Ближнеинфракрасные чувствительные к напряжению флуоресцентные красители, оптимизированные для оптического картирования в перфузируемом кровью миокарде». Heart Rhythm . 4 (11): 1441–1451. doi :10.1016/j.hrthm.2007.07.012. PMC 2121222 . PMID  17954405. 
30. Lee P, Yan P, Ewart P, Kohl P, Loew LM, Bollensdorff C (октябрь 2012 г.). «Одновременное измерение и модуляция нескольких физиологических параметров в изолированном сердце с использованием оптических методов». Pflügers Archiv . 464 (4): 403–414. doi :10.1007/s00424-012-1135-6. PMC 3495582. PMID  22886365 . 
31. Crocini C, Coppini R, Ferrantini C, Yan P, Loew LM, Tesi C и др. (октябрь 2014 г.). «Дефекты электрической активности T-канальцев лежат в основе локальных изменений высвобождения кальция при сердечной недостаточности». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 111 (42): 15196–15201. Bibcode : 2014PNAS..11115196C. doi : 10.1073/pnas.1411557111 . PMC 4210349. PMID  25288764 . 

Дальнейшее чтение

• Loew LM (январь 1996 г.). «Потенциометрические красители: визуализация электрической активности клеточных мембран». Pure and Applied Chemistry . 68 (7): 1405–1409. doi : 10.1351/pac199668071405 . S2CID  98804424.