Процесс частичного или полного изменения исходной вторичной, и/или третичной, и/или четвертичной структуры белков или нуклеиновых кислот, приводящий к потере биологической активности .
Примечание 1 : Изменено определение, данное в ссылке [1] .
Примечание 2 : Денатурация может происходить, когда белки и нуклеиновые кислоты подвергаются воздействию повышенной температуры или экстремальных значений pH, или нефизиологических концентраций соли, органических растворителей, мочевины или других химических агентов.
Примечание 3 : Фермент теряет способность изменять или ускорять химическую реакцию, когда он денатурируется. [2]
В биохимии денатурация — это процесс, при котором белки или нуклеиновые кислоты теряют складчатую структуру, имеющуюся в их нативном состоянии, из -за различных факторов, включая применение некоторого внешнего стресса или соединения, такого как сильная кислота или основание , концентрированная неорганическая соль, органический растворитель (например, спирт или хлороформ ), перемешивание и излучение или тепло . [3] Если белки в живой клетке денатурируются, это приводит к нарушению активности клетки и, возможно, к ее гибели . Денатурация белка также является следствием гибели клетки. [4] [5] Денатурированные белки могут проявлять широкий спектр характеристик: от конформационных изменений и потери растворимости или диссоциации кофакторов до агрегации из-за воздействия гидрофобных групп. Потеря растворимости в результате денатурации называется коагуляцией . [6] Денатурированные белки теряют свою трехмерную структуру и, следовательно, не могут функционировать.
Правильная укладка белка является ключом к тому, сможет ли глобулярный или мембранный белок правильно выполнять свою работу; он должен быть сложен в нативную форму, чтобы функционировать. Однако водородные связи и связывание кофактора с белком, которые играют решающую роль в укладке, довольно слабы и, таким образом, легко подвержены влиянию тепла, кислотности, различных концентраций соли, хелатирующих агентов и других стрессоров, которые могут денатурировать белок. Это одна из причин, по которой клеточный гомеостаз физиологически необходим в большинстве форм жизни .
Когда пища готовится, некоторые из ее белков денатурируются. Вот почему вареные яйца становятся твердыми, а вареное мясо — жестким.
Классический пример денатурации белков — яичные белки, которые, как правило, в основном представляют собой яичные альбумины в воде. Только что полученные из яиц яичные белки прозрачны и жидки. Приготовление термически нестабильных белков делает их непрозрачными, образуя взаимосвязанную твердую массу. [7] Такое же преобразование можно осуществить с помощью денатурирующего химиката. Выливание яичных белков в стакан с ацетоном также сделает яичные белки полупрозрачными и твердыми. Корочка, которая образуется на свернувшемся молоке, является еще одним распространенным примером денатурированного белка. Холодная закуска, известная как севиче, готовится путем химической «варки» сырой рыбы и моллюсков в кислом цитрусовом маринаде без нагревания. [8]
Денатурированные белки могут проявлять широкий спектр характеристик: от потери растворимости до агрегации белков .
Белки или полипептиды являются полимерами аминокислот . Белок создается рибосомами , которые «считывают» РНК, закодированную кодонами в гене, и собирают необходимую комбинацию аминокислот из генетической инструкции в процессе, известном как трансляция . Затем вновь созданная белковая цепь подвергается посттрансляционной модификации , в ходе которой добавляются дополнительные атомы или молекулы , например, медь , цинк или железо . После завершения этого процесса посттрансляционной модификации белок начинает сворачиваться (иногда спонтанно, а иногда с помощью ферментов ), сворачиваясь сам по себе, так что гидрофобные элементы белка оказываются глубоко внутри структуры, а гидрофильные элементы оказываются снаружи. Окончательная форма белка определяет, как он взаимодействует с окружающей средой.
Сворачивание белка состоит из баланса между значительным количеством слабых внутримолекулярных взаимодействий внутри белка (гидрофобные, электростатические и взаимодействия Ван-дер-Ваальса) и взаимодействиями белок-растворитель. [9] В результате этот процесс в значительной степени зависит от состояния окружающей среды, в которой находится белок. [9] Эти условия окружающей среды включают, но не ограничиваются, температурой , соленостью , давлением и растворителями, которые оказываются вовлеченными. [9] Следовательно, любое воздействие экстремальных стрессов (например, тепла или радиации, высоких концентраций неорганических солей, сильных кислот и оснований) может нарушить взаимодействие белка и неизбежно привести к денатурации. [10]
Когда белок денатурируется, вторичные и третичные структуры изменяются, но пептидные связи первичной структуры между аминокислотами остаются нетронутыми. Поскольку все структурные уровни белка определяют его функцию, белок больше не может выполнять свою функцию после того, как он денатурирован. Это контрастирует с внутренне неструктурированными белками , которые развернуты в своем нативном состоянии , но все еще функционально активны и имеют тенденцию к сворачиванию при связывании со своей биологической целью. [11]
Большинство биологических субстратов теряют свою биологическую функцию при денатурации. Например, ферменты теряют свою активность , поскольку субстраты больше не могут связываться с активным сайтом , [13] и поскольку аминокислотные остатки, участвующие в стабилизации переходных состояний субстратов, больше не расположены так, чтобы иметь возможность делать это. Процесс денатурации и связанную с ним потерю активности можно измерить с помощью таких методов, как двухполяризационная интерферометрия , CD , QCM-D и MP-SPR .
Известно, что тяжелые металлы, воздействуя на белки, нарушают функцию и активность, выполняемые белками. [14] Тяжелые металлы делятся на категории, состоящие из переходных металлов, а также определенного количества металлоидов . [14] Эти металлы при взаимодействии с нативными, свернутыми белками, как правило, играют роль в препятствовании их биологической активности. [14] Это вмешательство может осуществляться различными способами. Эти тяжелые металлы могут образовывать комплекс с функциональными группами боковой цепи, присутствующими в белке, или образовывать связи со свободными тиолами. [14] Тяжелые металлы также играют роль в окислении боковых цепей аминокислот, присутствующих в белке. [14] Наряду с этим, при взаимодействии с металлопротеинами тяжелые металлы могут смещать и заменять ключевые ионы металлов. [14] В результате тяжелые металлы могут мешать свернутым белкам, что может сильно сдерживать стабильность и активность белка.
Во многих случаях денатурация обратима (белки могут вернуться в свое исходное состояние, когда денатурирующее воздействие устранено). Этот процесс можно назвать ренатурацией . [15] Это понимание привело к представлению о том, что вся информация, необходимая для того, чтобы белки приняли свое исходное состояние, закодирована в первичной структуре белка, а следовательно, в ДНК , которая кодирует белок, так называемая « термодинамическая гипотеза Анфинсена ». [16]
Денатурация также может быть необратимой. Эта необратимость обычно является кинетической, а не термодинамической необратимостью, поскольку свернутый белок обычно имеет более низкую свободную энергию, чем когда он развернут. Благодаря кинетической необратимости тот факт, что белок застрял в локальном минимуме, может помешать ему когда-либо повторно сворачиваться после того, как он был необратимо денатурирован. [17]
Денатурация также может быть вызвана изменениями pH, которые могут повлиять на химию аминокислот и их остатков. Ионизируемые группы в аминокислотах способны ионизироваться при изменении pH. Изменение pH в сторону более кислых или более основных условий может вызвать разворачивание. [18] Разворачивание, вызванное кислотой, часто происходит между pH 2 и 5, разворачивание, вызванное основанием, обычно требует pH 10 или выше. [18]
Нуклеиновые кислоты (включая РНК и ДНК ) представляют собой нуклеотидные полимеры, синтезируемые ферментами полимеразами во время транскрипции или репликации ДНК . После 5'-3' синтеза остова отдельные азотистые основания способны взаимодействовать друг с другом посредством водородных связей , что позволяет формировать структуры более высокого порядка. Денатурация нуклеиновых кислот происходит, когда водородные связи между нуклеотидами разрушаются, и приводит к разделению ранее отожженных цепей. Например, денатурация ДНК из-за высоких температур приводит к разрыву пар оснований и разделению двухцепочечной спирали на две одинарные цепи. Цепи нуклеиновых кислот способны к повторному отжигу при восстановлении « нормальных » условий, но если восстановление происходит слишком быстро, цепи нуклеиновых кислот могут повторно отжигаться несовершенно, что приводит к неправильному спариванию оснований.
Нековалентные взаимодействия между антипараллельными цепями в ДНК могут быть разорваны, чтобы «открыть» двойную спираль , когда биологически важные механизмы, такие как репликация ДНК, транскрипция, репарация ДНК или связывание белков, должны произойти. [19] Область частично разделенной ДНК известна как пузырек денатурации, который можно более конкретно определить как открытие двойной спирали ДНК посредством скоординированного разделения пар оснований. [19]
Первая модель, которая попыталась описать термодинамику денатурационного пузыря, была введена в 1966 году и называлась моделью Поланда-Шераги. Эта модель описывает денатурацию цепей ДНК как функцию температуры . По мере повышения температуры водородные связи между парами оснований все больше нарушаются и начинают формироваться «денатурированные петли». [20] Однако модель Поланда-Шераги в настоящее время считается элементарной, поскольку она не учитывает запутывающие последствия последовательности ДНК , химического состава, жесткости и кручения . [21]
Недавние термодинамические исследования показали, что время жизни отдельного денатурационного пузырька составляет от 1 микросекунды до 1 миллисекунды. [22] Эта информация основана на установленных временных масштабах репликации и транскрипции ДНК. [22] В настоящее время [ когда? ] проводятся биофизические и биохимические исследования для более полного выяснения термодинамических деталей денатурационного пузырька. [22]
Поскольку полимеразная цепная реакция (ПЦР) является одним из самых популярных контекстов, в которых желательна денатурация ДНК, нагревание является наиболее частым методом денатурации. [23] Помимо денатурации под действием тепла, нуклеиновые кислоты могут подвергаться процессу денатурации с помощью различных химических агентов, таких как формамид , гуанидин , салицилат натрия , диметилсульфоксид (ДМСО), пропиленгликоль и мочевина . [24] Эти химические денатурирующие агенты понижают температуру плавления (T m ), конкурируя за доноры и акцепторы водородных связей с уже существующими парами азотистых оснований . Некоторые агенты даже способны вызывать денатурацию при комнатной температуре. Например, было показано, что щелочные агенты (например, NaOH) денатурируют ДНК, изменяя pH и удаляя протоны, способствующие образованию водородных связей. [23] Эти денатуранты были использованы для создания геля для денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGGE), который способствует денатурации нуклеиновых кислот с целью устранения влияния формы нуклеиновых кислот на их электрофоретическую подвижность. [25]
Оптическая активность (поглощение и рассеивание света) и гидродинамические свойства ( трансляционная диффузия , коэффициенты седиментации и время вращательной корреляции ) денатурированных формамидом нуклеиновых кислот аналогичны свойствам денатурированных нагреванием нуклеиновых кислот. [24] [26] [27] Поэтому, в зависимости от желаемого эффекта, химическая денатурация ДНК может обеспечить более щадящую процедуру денатурации нуклеиновых кислот, чем денатурация, вызванная нагреванием. Исследования, сравнивающие различные методы денатурации, такие как нагревание, бисерная мельница с различными размерами бусинок, зондовая ультразвуковая обработка и химическая денатурация, показывают, что химическая денатурация может обеспечить более быструю денатурацию по сравнению с другими описанными методами физической денатурации. [23] В частности, в случаях, когда желательна быстрая ренатурация, химические денатурирующие агенты могут стать идеальной альтернативой нагреванию. Например, цепи ДНК, денатурированные щелочными агентами, такими как NaOH, ренатурируют сразу после добавления фосфатного буфера . [23]
Небольшие электроотрицательные молекулы, такие как азот и кислород , которые являются основными газами в воздухе , значительно влияют на способность окружающих молекул участвовать в образовании водородных связей . [28] Эти молекулы конкурируют с окружающими акцепторами водородных связей за доноры водородных связей, поэтому действуют как «разрушители водородных связей» и ослабляют взаимодействия между окружающими молекулами в окружающей среде. [28] Антипараллельные нити в двойных спиралях ДНК нековалентно связаны водородными связями между парами оснований; [29] поэтому азот и кислород сохраняют потенциал ослабления целостности ДНК при воздействии воздуха. [30] В результате нити ДНК, подвергшиеся воздействию воздуха, требуют меньшего усилия для разделения и являются примером более низких температур плавления . [30]
Многие лабораторные методы основаны на способности цепей нуклеиновых кислот разделяться. Понимая свойства денатурации нуклеиновых кислот, были созданы следующие методы:
К кислым денатурантам белков относятся:
Основания действуют подобно кислотам при денатурации. Они включают:
Большинство органических растворителей являются денатурирующими, в том числе: [ необходима ссылка ]
Сшивающие агенты для белков включают: [ необходима ссылка ]
Хаотропные агенты включают: [ необходима цитата ]
Агенты, которые разрушают дисульфидные связи путем восстановления, включают: [ необходима ссылка ]
Такие агенты, как перекись водорода, элементарный хлор, хлорноватистая кислота (хлорная вода), бром, бромная вода, йод, азотная и окисляющие кислоты, а также озон реагируют с чувствительными молекулами, такими как сульфид/тиол, активированные ароматические кольца (фенилаланин), в результате чего белок повреждается и становится бесполезным.
К кислым денатурантам нуклеиновых кислот относятся:
К основным денатурантам нуклеиновых кислот относятся:
Другие денатуранты нуклеиновых кислот включают:
{{cite book}}: |journal=проигнорировано ( помощь ){{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ){{cite journal}}: Цитировать журнал требует |journal=( помощь )