Фазово-контрастная микроскопия (ФКМ) — это метод оптической микроскопии , который преобразует фазовые сдвиги света, проходящего через прозрачный образец, в изменения яркости изображения. Фазовые сдвиги сами по себе невидимы, но становятся видимыми, когда отображаются в виде изменений яркости.
Когда световые волны распространяются через среду, отличную от вакуума , взаимодействие со средой приводит к изменению амплитуды и фазы волны в зависимости от свойств среды. Изменения амплитуды (яркости) возникают в результате рассеяния и поглощения света, которое часто зависит от длины волны и может вызывать появление цветов. Фотоаппаратура и человеческий глаз чувствительны только к изменениям амплитуды. Поэтому без специальных мер фазовые изменения невидимы. Тем не менее, фазовые изменения часто несут важную информацию.
Фазово-контрастная микроскопия имеет особое значение в биологии. Он обнаруживает множество клеточных структур, невидимых в микроскоп светлого поля , как показано на рисунке. Эти структуры стали видны более ранним микроскопистам путем окрашивания , но это требовало дополнительной подготовки и гибели клеток. Фазово-контрастный микроскоп позволил биологам изучать живые клетки и то, как они размножаются посредством клеточного деления . Это один из немногих методов количественной оценки клеточной структуры и компонентов, не использующий флуоресценцию . [1] После своего изобретения в начале 1930-х годов [2] фазово-контрастная микроскопия оказалась таким достижением в микроскопии, что ее изобретатель Фриц Цернике был удостоен Нобелевской премии по физике в 1953 году . [3]
Основной принцип, позволяющий сделать фазовые изменения видимыми в фазово-контрастной микроскопии, состоит в том, чтобы отделить освещающий (фоновый) свет от света, рассеянного образцом (который составляет детали переднего плана), и по-разному манипулировать ими.
Кольцеобразный световой свет (зеленый), проходящий через кольцевое пространство конденсатора , фокусируется конденсором на образце. Часть освещающего света рассеивается образцом (желтый). Оставшийся свет не подвергается воздействию образца и образует фоновый свет (красный). При наблюдении неокрашенного биологического образца рассеянный свет слабый и обычно сдвинут по фазе на -90 ° (как из-за типичной толщины образцов, так и из-за разницы показателей преломления между биологической тканью и окружающей средой) относительно фонового света. Это приводит к тому, что передний план (синий вектор) и фон (красный вектор) имеют почти одинаковую интенсивность, что приводит к низкой контрастности изображения .
В фазово-контрастном микроскопе контраст изображения увеличивается двумя способами: за счет создания конструктивной интерференции между лучами рассеянного и фонового света в областях поля зрения, содержащих образец, и за счет уменьшения количества фонового света, попадающего в плоскость изображения. . [4] Во-первых, фоновый свет смещается по фазе на -90°, пропуская его через кольцо фазового сдвига, что устраняет разность фаз между фоном и лучами рассеянного света.
Когда свет затем фокусируется на плоскости изображения (где расположена камера или окуляр), этот фазовый сдвиг приводит к тому, что фоновые и рассеянные световые лучи, исходящие из областей поля зрения, содержащих образец (т. е. переднего плана), конструктивно интерферируют . , что приводит к увеличению яркости этих областей по сравнению с областями, не содержащими образец. Наконец, фон затемняется на ~70-90% серым кольцом фильтра ; этот метод максимизирует количество рассеянного света, генерируемого светом освещения, при этом минимизируя количество света освещения, достигающего плоскости изображения. Часть рассеянного света, освещающего всю поверхность фильтра, будет сдвинута по фазе и затемнена кольцами, но в гораздо меньшей степени, чем фоновый свет, который освещает только фазосдвигающее и серое кольца фильтра.
Вышеописанное описывает отрицательный фазовый контраст . В положительной форме фоновый свет сдвинут по фазе на +90°. Таким образом, фоновый свет будет сдвинут по фазе на 180° относительно рассеянного света. Затем рассеянный свет будет вычтен из фонового света, чтобы сформировать изображение с более темным передним планом и более светлым фоном, как показано на первом рисунке. [5] [6] [7]
Успех фазово-контрастного микроскопа привел к появлению ряда последующих методов фазовой визуализации . В 1952 году Жорж Номарски запатентовал то, что сегодня известно как дифференциально-интерференционно-контрастная (ДИК) микроскопия . [8] Он усиливает контраст, создавая искусственные тени, как будто объект освещен сбоку. Однако ДИК-микроскопия непригодна, когда объект или его контейнер меняют поляризацию. С ростом использования поляризационных пластиковых контейнеров в клеточной биологии, ДИК-микроскопия все чаще заменяется модуляционно-контрастной микроскопией Хоффмана , изобретенной Робертом Хоффманом в 1975 году. [9]
Традиционные методы фазового контраста улучшают контраст оптически, смешивая информацию о яркости и фазе в одном изображении. С момента появления цифровой камеры в середине 1990-х годов было разработано несколько новых методов цифровой фазовой визуализации, известных под общим названием количественная фазово-контрастная микроскопия . Эти методы в цифровом виде создают два отдельных изображения: обычное изображение в светлом поле и так называемое изображение с фазовым сдвигом . В каждой точке изображения изображение с фазовым сдвигом отображает количественный фазовый сдвиг, вызванный объектом, который пропорционален оптической толщине объекта. [10] Таким образом, измерение соответствующего оптического поля может устранить артефакты гало, связанные с обычным фазовым контрастом, путем решения оптической обратной задачи для компьютерного восстановления потенциала рассеяния объекта. [11]
