Циркадный ритм дрозофилы — это ежедневный 24-часовой цикл покоя и активности у плодовых мушек рода Drosophila . Биологический процесс был обнаружен и лучше всего изучен у вида Drosophila melanogaster . Многие формы поведения находятся под циркадным контролем, включая вылупление, локомоторную активность, питание и спаривание. Локомоторная активность максимальна на рассвете и в сумерках, тогда как вылупление происходит на рассвете. [1]
Биологические ритмы были впервые изучены у Drosophila pseudoobscura . Циркадные ритмы Drosophila проложили путь к пониманию циркадного поведения и заболеваний, связанных с состояниями сна-бодрствования у других животных, включая людей. Это связано с тем, что циркадные часы принципиально похожи. [2] Циркадный ритм Drosophila был открыт в 1935 году немецкими зоологами Гансом Калмусом и Эрвином Бюннингом . Американский биолог Колин С. Питтендри провел важный эксперимент в 1954 году, который установил, что циркадный ритм управляется биологическими часами. Генетика была впервые понята в 1971 году, когда Сеймур Бензер и Рональд Дж. Конопка сообщили, что мутация в определенных генах изменяет или останавливает циркадное поведение. Они открыли ген, называемый period ( per ), мутации которого изменяют циркадный ритм. Это был первый ген, который, как известно, контролирует поведение. Спустя десятилетие Конопка, Джеффри С. Холл , Майкл Росбаш и Майкл В. Янг открыли новые гены, включая timeless ( tim ), Clock ( Clk ), cycle ( cyc ), cry . Эти гены и их белки играют ключевую роль в циркадных часах. Исследования, проведенные в лаборатории Бензера, описаны в книге Джонатана Вайнера «Время, любовь, память» .
За свой вклад Холл, Росбаш и Янг получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 2017 году. [3]
В процессе вылупления, при котором взрослая муха появляется из куколки, дрозофила проявляет регулярную локомоторную активность (вибрацию), которая происходит в течение 8-10-часового интервала, начиная как раз перед рассветом. Существование этого циркадного ритма было независимо обнаружено у D. melanogaster в 1935 году двумя немецкими зоологами, Гансом Кальмусом в Зоологическом институте Немецкого университета в Праге (ныне Карлов университет ) и Эрвином Бюннингом в Ботаническом институте Йенского университета . [ 4] [5] В 1938 году Кальмус обнаружил, что за циркадную активность отвечает область мозга. [6] Кальмус и Бюннинг придерживались мнения, что температура является основным фактором. Но вскоре стало понятно, что даже при разной температуре циркадный ритм может оставаться неизменным. [7] В 1954 году Колин С. Питтендрих из Принстонского университета обнаружил важность условий света и темноты для D. pseudoobscura . Он продемонстрировал, что ритм вылупления задерживался, но не останавливался при понижении температуры. Он пришел к выводу, что температура влияла только на пиковый час ритма и не была главным фактором. [8] Тогда было известно, что циркадный ритм контролируется биологическими часами. Но природа часов тогда оставалась загадкой. [5]
Спустя почти два десятилетия существование циркадных часов было обнаружено Сеймуром Бензером и его студентом Рональдом Дж. Конопкой в Калифорнийском технологическом институте . Они обнаружили, что мутации в Х-хромосоме D. melanogaster могут вызывать аномальные циркадные активности. Когда определенная часть хромосомы отсутствовала (инактивировалась), циркадный ритм отсутствовал; в одной мутации (называемой per S , «S» для краткости или укороченный) ритм был сокращен до ~19 часов; тогда как в другой мутации ( per L , «L» для длинной или удлиненной) ритм был продлен до ~29 часов, в отличие от нормального 24-часового ритма. Они опубликовали открытие в 1971 году. [9] Они назвали местоположение гена ( локус ) периодом ( per для краткости), поскольку он контролирует период ритма. В противовес этому были и другие ученые, которые утверждали, что гены не могут контролировать такое сложное поведение, как циркадные активности. [10]
Другим циркадным поведением у Drosophila является ухаживание между самцом и самкой во время спаривания. Ухаживание включает песню, сопровождаемую ритуальным локомоторным танцем у самцов. Основная летная активность обычно происходит утром, а другой пик приходится на время перед закатом. Песня ухаживания производится вибрацией крыльев самца и состоит из импульсов тона, производимых с интервалом примерно 34 мс у D. melanogaster (48 мс у D. simulans ). В 1980 году Джеффри К. Холл и его студент Хараламбос П. Кириаку из Университета Брандейса в Уолтеме обнаружили, что активность ухаживания также контролируется геном per . [11] В 1984 году Конопка, Холл, Майкл Рошбаш и их команда сообщили в двух статьях, что per локус является центром циркадного ритма, и что потеря per останавливает циркадную активность. [12] [13] В то же время группа Майкла У. Янга из Рокфеллеровского университета сообщила о схожих эффектах per , и о том, что ген охватывает интервал в 7,1 килооснований (kb) на Х-хромосоме и кодирует 4,5 кб поли(A)+ РНК. [14] [15] В 1986 году они секвенировали весь фрагмент ДНК и обнаружили, что ген кодирует 4,5 кб РНК, которая производит белок, протеогликан , состоящий из 1127 аминокислот. [16] В то же время группа Рошбаша показала, что белок PER отсутствует в мутантном per . [17] В 1994 году Янг и его группа открыли ген timeless ( tim ), который влияет на активность per . [18] В 1998 году они открыли doubletime ( dbt ), который регулирует количество белка PER. [19]
В 1990 году Конопка, Росбаш и идентифицировали новый ген под названием Clock ( Clk ), который жизненно важен для циркадного периода. [20] В 1998 году они обнаружили новый ген cycle ( cyc ), который действует вместе с Clk . [21] В конце 1998 года команда Холла и Рошбаша обнаружила cryb , ген чувствительности к синему свету. [22] Они одновременно идентифицировали белок CRY как основную светочувствительную ( фоторецепторную ) систему. Активность cry находится под циркадной регуляцией и на нее влияют другие гены, такие как per , tim , clk и cyc . [23] Продукт гена CRY является основным фоторецепторным белком, принадлежащим к классу флавопротеинов , называемых криптохромами . Они также присутствуют в бактериях и растениях. [24] В 1998 году Холл и Джей Х. Парк выделили ген, кодирующий нейропептид, названный фактором дисперсии пигмента (PDF), на основе одной из ролей, которую он играет у ракообразных . [25] В 1999 году они обнаружили, что pdf экспрессируется латеральными нейронными вентральными кластерами (LNv), что указывает на то, что белок PDF является основным циркадным нейромедиатором , а нейроны LNv являются основными циркадными водителями ритма. [26] В 2001 году Янг и его команда продемонстрировали, что ортолог гликогенсинтазы киназы-3 (GSK-3) shaggy (SGG) является ферментом, который регулирует созревание и накопление TIM в начале ночи, вызывая фосфорилирование . [27]
Холл, Росбаш и Янг разделили Нобелевскую премию по физиологии и медицине 2017 года «за открытие молекулярных механизмов, контролирующих циркадный ритм» [3] .
У дрозофилы есть две отдельные группы циркадных часов: часовые нейроны и часовые гены. Они действуют согласованно, чтобы производить 24-часовой цикл покоя и активности. Свет является источником активации часов. Сложные глаза , глазки и глазки Хофбауэра-Бюхнера (глазки HB) являются прямыми внешними фоторецепторными органами. Но циркадные часы могут работать в постоянной темноте. [28] Тем не менее, фоторецепторы необходимы для измерения продолжительности дня и обнаружения лунного света. Сложные глаза важны для дифференциации длинных дней от постоянного света. Для нормальных маскирующих эффектов света, таких как индуцирование активности светом и торможение темнотой. [29] Существует два отдельных пика активности, называемых пиком М (утренний), происходящим на рассвете, и пиком Е (вечерний), в сумерках. Они отслеживают разную продолжительность дня в разные сезоны года. [30] Светочувствительные белки в глазу, называемые родопсинами (родопсин 1 и 6), играют решающую роль в активации колебаний M и E. [31] При обнаружении окружающего света в мозге около 150 нейронов (в мозге дрозофилы их около 100 000) регулируют циркадный ритм. [32] Часовые нейроны расположены в отдельных кластерах в центральном мозге. Наиболее изученными часовыми нейронами являются большие и малые латеральные вентральные нейроны (l-LNvs и s-LNvs) в основании зрительной доли . Эти нейроны вырабатывают фактор дисперсии пигмента (PDF), нейропептид, который действует как циркадный нейромодулятор между различными часовыми нейронами. [33]
Циркадный ритм Drosophila отслеживает время посредством ежедневных колебаний связанных с часами белков, которые взаимодействуют в петле обратной связи транскрипции-трансляции. Основной механизм часов состоит из двух взаимозависимых петель обратной связи, а именно петли PER/TIM и петли CLK/CYC. [34] Петля CLK/CYC происходит в течение дня, когда вырабатываются как белок Clock, так и белок Cycle. Гетеродимеры CLK/CYC действуют как факторы транскрипции и связываются вместе, чтобы инициировать транскрипцию генов per и tim , связываясь с элементом промотора, называемым E-box, около полудня. ДНК транскрибируется для производства мРНК PER и мРНК TIM. Белки PER и TIM синтезируются в цитоплазме и демонстрируют плавное увеличение уровней в течение дня. Уровни их РНК достигают пика рано вечером, а уровни белка достигают пика около рассвета. [32] Но уровни их белка поддерживаются на постоянно низком уровне до наступления темноты, потому что дневной свет также активирует ген double-time ( dbt ). Белок DBT вызывает посттрансляционные модификации , то есть фосфорилирование и оборот мономерных белков PER. Поскольку PER транслируется в цитоплазме, он активно фосфорилируется DBT ( казеинкиназа 1 ε) и казеинкиназа 2 (синтезируется And и Tik ) в качестве прелюдии к преждевременной деградации. Фактическая деградация происходит через убиквитин-протеасомный путь и осуществляется убиквитинлигазой, называемой Slimb (дополнительные конечности). [35] [36] В то же время TIM сам фосфорилируется shaggy, активность которого снижается после захода солнца. DBT постепенно исчезает, а изъятие DBT способствует стабилизации молекул PER путем физической ассоциации с TIM. Следовательно, максимальная продукция PER и TIM происходит в сумерках. В то же время CLK/CYC также напрямую активирует vri и Pdp1 (ген белка домена PAR 1). VRI накапливается первым, на 3-6 часов раньше, и начинает подавлять Clk ; но входящий PDP1 создает конкуренцию, активируя Clk . Димеры PER/TIM накапливаются в начале ночи, транслоцируются организованным образом в ядро несколько часов спустя и связываются с димерами CLK/CYC. Связанный PER полностью останавливает транскрипционную активность CLK и CYC. [37]
Ранним утром появление света заставляет белки PER и TIM разрушаться в сети транскрипционной активации и репрессии. Во-первых, свет активирует ген cry в нейронах часов. Хотя CRY вырабатывается глубоко внутри мозга, он чувствителен к УФ- и синему свету, и поэтому он легко сигнализирует клеткам мозга о появлении света. Он необратимо и напрямую связывается с TIM, заставляя его разрушаться через протеосомо-зависимую убиквитин-опосредованную деградацию. Домен гомологии фотолиазы CRY используется для обнаружения света и фототрансдукции , тогда как домен карбоксильного конца регулирует стабильность CRY, взаимодействие CRY-TIM и циркадную фоточувствительность. [38] Убиквитинирование и последующая деградация поддерживаются другим белком JET. [39] Таким образом, димер PER/TIM диссоциирует, и несвязанный PER становится нестабильным. PER подвергается прогрессивному фосфорилированию и в конечном итоге деградации. Отсутствие PER и TIM позволяет активировать гены clk и cyc . Таким образом, часы сбрасываются для начала следующего циркадного цикла. [10]