CLOCK ( бэкроним для фразы «циркадные локомоторные выходные циклы капут ») — это ген, кодирующий базовый фактор транскрипции спираль-петля-спираль — PAS , который, как известно, влияет как на постоянство, так и на период циркадных ритмов .
Исследования показывают, что ген CLOCK играет важную роль в качестве активатора последующих элементов в пути, имеющем решающее значение для генерации циркадных ритмов . [5] [6]
Ген CLOCK был впервые идентифицирован в 1997 году Джозефом Такахаши и его коллегами. Такахаши использовал прямой мутагенез скрининга мышей, обработанных N-этил-N-нитрозомочевиной, для создания и идентификации мутаций в ключевых генах, которые в целом влияют на циркадную активность. [7] Мутанты CLOCK , обнаруженные с помощью скрининга, демонстрировали аномально длительный период суточной активности. Эта черта оказалась наследуемой . Мыши, выведенные гетерозиготными, демонстрировали более длительные периоды в 24,4 часа по сравнению с контрольным периодом в 23,3 часа. Мыши, гомозиготные по мутации, демонстрировали периоды в 27,3 часа, но в конечном итоге теряли всю циркадную ритмичность после нескольких дней в постоянной темноте. [8] Это показало, что «неповрежденные гены CLOCK » необходимы для нормальной циркадной функции млекопитающих, поскольку эти мутации были полудоминантными. [8]
Было обнаружено, что белок CLOCK играет центральную роль в качестве фактора транскрипции в циркадном пейсмейкере. [9] У Drosophila вновь синтезированный CLOCK (CLK) гипофосфорилируется в цитоплазме перед попаданием в ядро. Попав в ядро, CLK локализуется в ядерных фокусах и позже перераспределяется однородно. CYCLE (CYC) (также известный как dBMAL для ортолога BMAL1 у млекопитающих) димеризуется с CLK через их соответствующие домены PAS . Затем этот димер рекрутирует коактиватор CREB-связывающего белка (CBP) и далее фосфорилируется. [10] После фосфорилирования этот комплекс CLK-CYC связывается с элементами E-box промоторов period (per) и timeless (tim) через свой домен bHLH, вызывая стимуляцию экспрессии генов per и tim . Большой молярный избыток периодического (PER) и вневременного (TIM) белков вызывает образование гетеродимера PER-TIM, который предотвращает связывание гетеродимера CLK-CYC с E-боксами per и tim , по сути блокируя транскрипцию per и tim . [6] [11] CLK гиперфосфорилируется , когда киназа doubletime (DBT) взаимодействует с комплексом CLK-CYC зависимым от PER образом, дестабилизируя как CLK, так и PER, что приводит к деградации обоих белков. [11] Гипофосфорилированный CLK затем накапливается, связывается с E-боксами per и tim и снова активирует их транскрипцию. [11] Этот цикл посттрансляционного фосфорилирования предполагает, что временное фосфорилирование CLK помогает в механизме синхронизации циркадных часов. [10]
Похожая модель обнаружена у мышей, у которых BMAL1 димеризуется с CLOCK для активации транскрипции per и криптохрома ( cry ). Белки PER и CRY образуют гетеродимер, который действует на гетеродимер CLOCK-BMAL для подавления транскрипции per и cry . [12] Гетеродимер CLOCK:BMAL1 функционирует аналогично другим комплексам активаторов транскрипции; CLOCK:BMAL1 взаимодействует с регуляторными элементами E-box. Белки PER и CRY накапливаются и димеризуются в течение субъективной ночи и транслоцируются в ядро для взаимодействия с комплексом CLOCK:BMAL1, напрямую подавляя их собственную экспрессию. Это исследование было проведено и подтверждено с помощью кристаллографического анализа. [13]
CLOCK проявляет активность гистонацетилтрансферазы (HAT), которая усиливается димеризацией с BMAL1. [14] Доктор Паоло Сассоне-Корси и его коллеги продемонстрировали in vitro , что опосредованная CLOCK активность HAT необходима для восстановления циркадных ритмов у мутантов Clock. [14]
Димер CLOCK-BMAL участвует в регуляции других генов и обратных связей. Фермент SIRT1 также связывается с комплексом CLOCK-BMAL и подавляет его активность, возможно, путем деацетилирования Bmal1 и окружающих гистонов . [15] Однако роль SIRT1 все еще остается спорной, и он также может играть роль в деацетилировании белка PER, направляя его на деградацию. [16]
Димер CLOCK-BMAL действует как положительное звено петли обратной связи. Связывание CLOCK-BMAL с элементом промотора E-box активирует транскрипцию генов часов, таких как per 1, 2 и 3 и tim у мышей. Было показано, что у мышей CLOCK-BMAL также активирует ген никотинамидфосфорибозилтрансферазы (также называемый Nampt ), часть отдельной петли обратной связи. Эта петля обратной связи создает метаболический осциллятор. Димер CLOCK-BMAL активирует транскрипцию гена Nampt , который кодирует белок NAMPT. NAMPT является частью серии ферментативных реакций, которые преобразуют ниацин (также называемый никотинамидом ) в NAD . SIRT1, которому для его ферментативной активности требуется NAD, затем использует повышенные уровни NAD для подавления BMAL1 посредством деацетилирования. Это подавление приводит к меньшей транскрипции NAMPT, меньшему количеству белка NAMPT, меньшему производству NAD и, следовательно, меньшему количеству SIRT1 и меньшему подавлению димера CLOCK-BMAL. Этот димер может снова положительно активировать транскрипцию гена Nampt , и цикл продолжается, создавая еще одну колебательную петлю, включающую CLOCK-BMAL в качестве положительных элементов. Ключевая роль, которую Clock играет в метаболических и циркадных циклах, подчеркивает тесную связь между метаболизмом и циркадными часами. [17]
Первые циркадные ритмы , скорее всего, были созданы управляемыми светом циклами деления клеток у предковых прокариотических видов. [18] Этот проторитм позже развился в самоподдерживающиеся часы посредством дупликации генов и функциональной дивергенции генов часов. Кластеры генов kaiA / B / C остаются старейшими из генов часов, поскольку они присутствуют у цианобактерий , причем kai C, скорее всего, является предком kai A и kaiB. [18] Функция этих предковых генов часов, скорее всего, была связана с функцией хромосом до того, как развился механизм синхронизации. [18] Гены kai A и kai B возникли после того, как цианобактерии отделились от других прокариот. [19] Суровые климатические условия в ранней истории формирования Земли, такие как УФ-облучение, могли привести к диверсификации генов часов у прокариот в ответ на резкие изменения климата. [19]
Криптохромы , светочувствительные белки, регулируемые генами Cry , скорее всего, являются потомками kaiC, возникшими в результате дупликации генома, предшествовавшей кембрийскому взрыву , и отвечают за негативную регуляцию циркадных часов. Другие отдельные линии генов часов возникли на ранней стадии эволюции позвоночных, при этом ген BMAL1 паралогичен CLOCK. Однако их общий предок, скорее всего, существовал до разделения насекомых и позвоночных примерно за 500 млн лет до нашей эры. [18] WC1, аналог CLOCK/BMAL1, обнаруженный в геномах грибов, является предполагаемым кандидатом на роль общего предка, существовавшего до разделения грибов и животных . [18] Поиск BLAST, проведенный в обзоре эволюции генов часов в 2004 году, показал, что ген Clock мог возникнуть в результате дупликации гена BMAL1, хотя эта гипотеза остается спекулятивной. [18] Другая теория в качестве альтернативы предлагает ген NPAS2 как паралог CLOCK, который выполняет аналогичную роль в пути циркадного ритма, но в других тканях. [20]
В частности, предполагается, что аллельные вариации в гене Clock1a влияют на сезонные сроки согласно исследованию 2014 года, проведенному в популяции карповых рыб. [21] Полиморфизмы в гене в основном влияют на длину области домена PolyQ, предоставляя пример дивергентной эволюции , где виды, разделяющие экологическую нишу, будут разделять ресурсы в сезонно-изменяющихся средах. [21] Длина домена PolyQ связана с изменениями в уровне транскрипции CLOCK. В среднем, более длинные длины аллелей коррелировали с недавно полученными видами и видами с более ранним нерестом, скорее всего, из-за сезонных изменений температуры воды. [21] Исследователи предполагают, что длина домена может служить для компенсации изменений температуры путем изменения скорости транскрипции CLOCK. Все другие аминокислоты остались идентичными у местных видов, что указывает на то, что функциональное ограничение может быть еще одним фактором, влияющим на эволюцию гена CLOCK в дополнение к дупликации гена и диверсификации . [20] [21]
В одном исследовании 2017 года, посвященном изучению роли экспрессии CLOCK в нейронах, была определена его функция в регуляции транскрипционных сетей, которая может дать представление об эволюции человеческого мозга. [22] Исследователи синтезировали дифференцированные человеческие нейроны in vitro , а затем выполнили нокдаун гена, чтобы проверить влияние CLOCK на сигнализацию нейронных клеток. Когда активность CLOCK была нарушена, наблюдалась повышенная нейронная миграция ткани в неокортексе , что предполагает молекулярный механизм расширения коры, уникальный для развития человеческого мозга. [22] Однако точную роль CLOCK в метаболической регуляции корковых нейронов еще предстоит определить. Другое исследование, изучающее связь между полиморфизмами CLOCK в 3'-фланкирующей области и предпочтением утра/вечера у взрослых, обнаружило корреляцию между субъектами с аллелем 3111C и предпочтением вечерних часов на основе ответов, предоставленных в оцениваемой анкете. [23] Этот регион хорошо сохраняется у мышей и людей, и было показано, что полиморфизмы влияют на стабильность мРНК, указывая на то, что аллельные варианты могут нарушать нормальные циркадные паттерны у млекопитающих, приводя к таким состояниям, как бессонница или другие нарушения сна. [23]
Организмы с мутацией Clock могут обладать либо нулевой мутацией, либо антиморфным аллелем в локусе Clock , который кодирует антагонист белка дикого типа. Присутствие антиморфного белка подавляет транскрипционные продукты, которые обычно активируются Clock . [24]
У дрозофилы мутантная форма Clock ( Jrk ) была идентифицирована Алладой, Холлом и Росбашем в 1998 году. Команда использовала прямую генетику для выявления нециркадных ритмов у мутантных мух. Jrk возникает из-за преждевременного стоп-кодона , который устраняет домен активации белка CLOCK. Эта мутация вызывает доминантные эффекты: у половины гетерозиготных мух с этим мутантным геном период удлинен на 24,8 часа, в то время как у другой половины он становится аритмичным. Гомозиготные мухи теряют циркадный ритм. Кроме того, те же исследователи продемонстрировали, что эти мутантные мухи экспрессируют низкие уровни белков PER и TIM, что указывает на то, что Clock функционирует как положительный элемент в циркадной петле. Хотя мутация влияет на циркадные часы мухи, она не вызывает никаких физиологических или поведенческих дефектов. [25] Схожая последовательность между Jrk и его мышиным гомологом предполагает, что общие компоненты циркадного ритма присутствовали как у предков дрозофилы , так и у мышей. Рецессивный аллель Clock приводит к поведенческой аритмичности, сохраняя при этом обнаруживаемые молекулярные и транскрипционные колебания. Это предполагает, что Clk вносит вклад в амплитуду циркадных ритмов. [26]
Гомологом мутанта Jrk у мышей является мутант ClockΔ19 , который имеет делецию в экзоне 19 гена Clock . Эта доминантно-негативная мутация приводит к дефектному димеру CLOCK-BMAL, что приводит к снижению способности мышей активироваться за транскрипцию. В постоянной темноте мыши ClockΔ19 , гетерозиготные по аллелю мутанта Clock , демонстрируют удлиненные циркадные периоды, в то время как мыши ClockΔ19/Δ19, гомозиготные по аллелю, становятся аритмичными. [8] Как у гетерозигот, так и у гомозигот эта мутация также вызывает удлиненные периоды и аритмичность на уровне отдельных клеток. [27]
Мыши с мутантным геном Clock -/- null, у которых Clock был отключен, демонстрируют совершенно нормальные циркадные ритмы. Открытие мутанта с мутантным геном Clock и фенотипом дикого типа напрямую поставило под сомнение общепринятое предположение о том, что Clock необходим для нормальной циркадной функции. Кроме того, это предполагает, что димер CLOCK-BMAL1 не обязательно должен существовать для модуляции других элементов циркадного пути. [28] Нейрональный домен PAS, содержащий белок 2 ( NPAS2 , паралог CLOCK [29] ), может заменить CLOCK у этих мышей с нулевым геном Clock . Мыши с одним аллелем NPAS2 сначала показали более короткие периоды, но в конечном итоге аритмическое поведение. [30]
У людей полиморфизм в Clock , rs6832769, может быть связан с чертой личности — уступчивостью . [31] Другой полиморфизм одного нуклеотида (SNP) в Clock , 3111C, связанный с дневными предпочтениями, [23] также связан с повышенной бессонницей , [32] трудностями в потере веса, [33] и рецидивами серьезных депрессивных эпизодов у пациентов с биполярным расстройством . [34]
У мышей Clock был связан с расстройствами сна , метаболизма , беременности и расстройствами настроения . Мыши-мутанты Clock спят меньше, чем нормальные мыши каждый день. [35] У мышей также наблюдаются измененные уровни глюкозы в плазме и ритмы приема пищи. [36] У этих мутантов со временем развиваются симптомы метаболического синдрома . [36] Кроме того, у мутантов Clock наблюдаются нарушенные эстральные циклы и повышенные показатели невынашивания беременности в срок. [37] Мутант Clock также был связан с симптомами, похожими на биполярное расстройство, у мышей, включая манию и эйфорию . [38] Мыши-мутанты Clock также демонстрируют повышенную возбудимость дофаминовых нейронов в центрах вознаграждения мозга. [39] Эти результаты побудили Коллин МакКлунг предложить использовать мышей-мутантов Clock в качестве модели расстройств настроения и поведения человека.
Также было показано, что димер CLOCK-BMAL активирует обратный рецептор erb альфа ( Rev-ErbA альфа ) и рецептор ретиноевой кислоты-сироты альфа ( ROR-альфа ). REV-ERBα и RORα регулируют Bmal , связываясь с элементами ответа рецептора-сироты, связанными с ретиноевой кислотой (ROREs) в его промоторе. [40] [41]
Изменения в эпигенетике гена Clock могут привести к повышенному риску рака молочной железы . [42] Было обнаружено, что у женщин с раком молочной железы наблюдалось значительно меньшее метилирование промотора Clock . Также было отмечено, что этот эффект был сильнее у женщин с опухолями, отрицательными по рецепторам эстрогена и прогестерона. [43]
Ген CLOCK также может быть целью соматических мутаций при микросателлитном нестабильном колоректальном раке . В одном исследовании 53% случаев микросателлитного нестабильного колоректального рака содержали соматические мутации CLOCK. [44] Зарождающиеся исследования экспрессии циркадных генов в жировой ткани предполагают, что подавление гена CLOCK может причинно коррелировать не только с ожирением, но и с диабетом 2 типа, [45] с количественными физическими реакциями на циркадное потребление пищи как потенциальными входами в часовую систему. [46]