Элемент раскручивания ДНК ( DUE или DNAUE ) является местом инициации для открытия двойной спирали ДНК в точке начала репликации для синтеза ДНК . [1] Он богат AT и легко денатурирует из-за своей низкой спиральной стабильности, [2] что позволяет комплексу распознавания начала распознавать одноцепочечную область .
DUE встречаются как в прокариотических , так и в эукариотических организмах, но впервые были обнаружены в дрожжах и бактериях Хуангом Ковальски. [3] [4] Раскручивание ДНК обеспечивает доступ репликативного аппарата к новым одиночным цепям. [1] У эукариот DUE являются местом связывания для белков, связывающих раскручивающийся элемент ДНК (DUE-B), необходимых для инициации репликации. [3] У прокариот DUE встречаются в форме тандемных консенсусных последовательностей , фланкирующих 5'-конец домена связывания DnaA. [2] Процесс раскручивания в этих богатых AT элементах происходит даже при отсутствии каких-либо связывающих белков начала из-за отрицательных сил суперспирализации , что делает его энергетически выгодным действием. [2] DUE обычно встречаются на расстоянии 30–100 п.н. от начала репликации. [4] [5]
Специфическое раскручивание DUE позволяет производить сборку комплекса инициации в месте репликации на одноцепочечной ДНК, как обнаружил Хуан Ковальски. [4] ДНК -хеликаза и связанные с ней ферменты теперь способны связываться с раскрученной областью, создавая начало репликационной вилки . Раскручивание этой дуплексной области цепи связано с низким потреблением свободной энергии из-за спиральной нестабильности, вызванной специфическими взаимодействиями укладки оснований, в сочетании с противодействием суперспирализации. [4] [6] Отрицательная суперспирализация позволяет ДНК оставаться стабильной при плавлении, что обусловлено снижением напряжения кручения. [5] Обнаружено в точках начала репликации как бактерий, так и дрожжей, а также присутствует у некоторых млекопитающих. [5] Установлено, что ее длина составляет от 30 до 100 п.н. [4] [5]
У прокариот репликация ДНК в большинстве случаев происходит из одной единственной точки начала репликации на одной единственной нити последовательности ДНК. Независимо от того, является ли этот геном линейным или кольцевым, у бактерий есть собственные механизмы, необходимые для репликации. [7]
У бактерий белок DnaA является инициатором репликации. [8] Он загружается на oriC в последовательности DnaA box, где он связывается и собирает нити, чтобы открыть дуплекс и привлечь DnaB helicase с помощью DnaC . DnaA высококонсервативный и имеет два домена связывания ДНК. Прямо перед этим DnaA box находятся три тандемные 13-мерные последовательности. Эти тандемные последовательности, обозначенные L, M, R от 5' до 3', являются бактериальными DUE. Два из трех этих богатых AT регионов (M и R) раскручиваются при связывании DnaA с DnaA box, через близкое расположение к раскручивающемуся дуплексу. Последняя 13-мерная последовательность L, самая дальняя от этого DnaA box, в конечном итоге раскручивается при DnaB helicase, окружающем его. Это образует репликационный пузырь для продолжения репликации ДНК. [2]
Археи используют более простой гомолог комплекса распознавания начала эукариот для поиска начала репликации в последовательностях, называемых полем распознавания начала (ORB). [9]
Раскручивание этих трех DUE является необходимым шагом для начала репликации ДНК. Дистанционное натяжение от плавления дуплекса в последовательности DnaA-бокса — это то, что вызывает дальнейшее плавление в сайтах M и R DUE. Более удаленный сайт L затем раскручивается связыванием DnaB. Раскручивание этих 13-мерных сайтов не зависит от белков, связывающих oriC. Раскручивание вызывает генерация отрицательной суперспирализации. [2]
Скорости раскручивания ДНК в трех DUE E. coli были экспериментально сравнены с помощью ядерной резонансной спектроскопии. В физиологических условиях эффективность открытия каждой из AT-богатых последовательностей отличалась друг от друга. Во многом из-за различных отдаленно окружающих последовательностей. [2]
Кроме того, было обнаружено, что плавление пар оснований AT/TA происходит намного быстрее, чем плавление пар GC/CG (15-240 с −1 против ~20 с −1 ). Это подтверждает идею о том, что последовательности AT эволюционно предпочтительны в элементах DUE из-за их легкости раскручивания. [2]
Три 13-мерные последовательности, идентифицированные как DUE в E. coli , хорошо сохраняются в точке начала репликации всех документированных кишечных бактерий . Общая консенсусная последовательность была получена путем сравнения консервативных бактерий для формирования 11-основной последовательности, GATCTnTTnTTTT . E. coli содержит 9 оснований из 11-основной консенсусной последовательности в своем oriC, в 13-мерных последовательностях. Эти последовательности находятся исключительно в единственной точке начала репликации; больше нигде в последовательности генома. [2]
Механизмы репликации эукариот работают примерно так же, как и у прокариот, но находятся под более тонкой регуляцией. [10] Необходимо гарантировать, что каждая молекула ДНК реплицируется только один раз и что это происходит в нужном месте в нужное время. [7] Действует в ответ на внеклеточные сигналы, которые координируют начало деления, по-разному от ткани к ткани. Внешние сигналы запускают репликацию в S-фазе посредством продукции циклинов , которые активируют циклин-зависимые киназы (CDK) для образования комплексов. [10]
Репликация ДНК у эукариот начинается с связывания комплекса распознавания происхождения (ORC) с источником. Это происходит в фазе клетки G 1, которая служит для продвижения клеточного цикла вперед в фазу S. Это связывание позволяет дополнительно связывать факторы для создания пререпликативного комплекса (pre-RC). Pre-RC запускается для инициации, когда циклин-зависимая киназа (CDK) и Dbf4-зависимая киназа (DDK) связываются с ним. Затем комплексы инициации позволяют рекрутировать активатор MCM геликазы Cdc45 и последующее раскручивание дуплекса в источнике. [10] [11]
Репликация у эукариот начинается на нескольких участках последовательности, образуя одновременно несколько репликационных вилок . Такая эффективность необходима для больших геномов, которые им необходимо реплицировать. [10]
У эукариот структуры нуклеосом могут усложнять инициацию репликации. [4] Они могут блокировать доступ DUE-B к DUE, тем самым подавляя инициацию транскрипции. [4] Могут препятствовать скорости. Линейная природа эукариотической ДНК, в отличие от прокариотической кольцевой ДНК, тем не менее, позволяет легче раскручивать ее дуплекс после того, как он был должным образом раскручен из нуклеосомы. [4] Активность DUE может модулироваться факторами транскрипции, такими как ABF1. [4]
Распространенной модельной системой дрожжей, которая хорошо представляет эукариотическую репликацию, является Saccharomyces cerevisiae . [12] Она обладает автономно реплицирующимися последовательностями (ARS), которые трансформируются и хорошо поддерживаются в плазмиде. Некоторые из этих ARS, как видно, действуют как точки начала репликации. Эти ARS состоят из трех доменов A, B и C. Домен A - это то место, где находится консенсусная последовательность ARS [5] , называемая ACS. Домен B содержит DUE. Наконец, домен C необходим для облегчения белок-белковых взаимодействий . [12] ARS обнаружены распределенными по 16 хромосомам, повторяющимися каждые 30–40 кб. [12]
Между видами эти последовательности ARS изменчивы, но их домены A, B и C хорошо сохраняются. [12] Любые изменения в DUE (домене B) вызывают более низкую общую функцию ARS в целом при инициации репликации. Это было обнаружено с помощью исследований с использованием иминообмена и ЯМР-спектроскопии . [2]
На сегодняшний день DUE обнаружены в некоторых источниках репликации млекопитающих. В целом, очень мало источников репликации млекопитающих были хорошо проанализированы, поэтому сложно определить, насколько распространены DUE в их определенных источниках репликации. [5]
Человеческие клетки до сих пор имеют очень мало подробностей об их происхождении. [5] Известно, что репликация начинается в больших зонах инициации, связанных с известными белками, такими как ген c-myc и β-глобина. Считается, что клетки с DUE действуют почти так же, как дрожжевые клетки. [5]
Обнаружено, что DUE в происхождении плазмид в клетках млекопитающих, SV40 , связан с гексамером T-ag, который вводит противоположную суперспирализацию, чтобы увеличить благоприятность раскручивания цепи. [4]
Млекопитающие с DUE продемонстрировали доказательства структурообразующих способностей, которые обеспечивают одноцепочечную стабильность раскрученной ДНК. К ним относятся крестообразные , внутримолекулярные триплексы и многое другое. [5]
Белки элементов раскручивания ДНК (DUE-B) обнаружены у эукариот. [3]
Они действуют, инициируя разделение цепей путем связывания с DUE. [3] Гомологи последовательности DUE-B обнаружены среди различных видов животных - рыб, амфибий и грызунов. [3] DUE-B имеют неупорядоченные C-концевые домены, которые связываются с DUE путем распознавания этого C-конца. [3] Никакая другая специфичность последовательности не участвует в этом взаимодействии. [3] Подтверждено путем индукции мутаций по длине последовательности DUE-B, но во всех случаях способность к димеризации остается нетронутой. [3] После связывания ДНК C-конец становится упорядоченным, что придает большую устойчивость к деградации протеазой . [3] DUE-B состоят из 209 остатков в общей сложности, 58 из которых неупорядочены до связывания с DUE. [3] DUE-B гидролизуют АТФ для того, чтобы функционировать. [3] Также обладают последовательностью, похожей на аминоацил-тРНК-синтетазу , и ранее были классифицированы как таковая. [13] DUE-B образуют гомодимеры , которые создают расширенную вторичную структуру бета-слоя, простирающуюся через него. [3] Два из этих гомодимеров объединяются, образуя общую асимметричную структуру DUE-B. [3]
При формировании пре-RC Cdc45 локализуется в DUE для активности посредством взаимодействия с DUE-B. [11] Позволяет раскручивать дуплекс и инициировать репликацию. [11]
У людей DUE-B на 60 аминокислот длиннее своих дрожжевых ортологов . [13] Оба локализованы в основном в ядре. [13]
Уровни DUE-B находятся в постоянном количестве, независимо от клеточного цикла. [13] Однако в S-фазе DUE-B могут временно фосфорилироваться для предотвращения преждевременной репликации. [13] Активность DUE-B контролируется ковалентно. [13] Сборка этих DUE-B в областях DUE зависит от локальной активности киназы и фосфатазы. [13] DUE-B также могут подавляться siRNA и были вовлечены в расширенные стадии G1 . [13]
Мутации, которые нарушают раскручивание в сайтах DUE, напрямую препятствуют активности репликации ДНК. [14] Это может быть результатом делеций/изменений в регионе DUE, добавления реактивных реагентов или добавления специфической нуклеазы . [4] Сайты DUE относительно нечувствительны к точечным мутациям , сохраняя свою активность при изменении оснований в сайтах связывания белков. [4] Во многих случаях активность DUE может быть частично восстановлена путем повышения температуры. [4] Может быть восстановлена также путем повторного добавления сайта DUE. [3]
Если мутация DUE достаточно серьезна и приводит к тому, что он больше не связывается с DUE-B, Cdc45 не может ассоциироваться и не будет связываться с фактором транскрипции c-myc. Это может быть восстановлено в связанных с заболеванием (ATTCT)(n) расширениях длины последовательности DUE. Если активность DUE восстановится в избытке, это может вызвать нерегулируемое образование начала и прогрессирование клеточного цикла. [11]
У эукариот, когда DUE-B выведены из строя, клетка не перейдет в S-фазу своего цикла, где происходит репликация ДНК. Это приведет к усилению апоптоза . [3] Но активность может быть восстановлена путем повторного добавления DUE-B, даже от другого вида. Это связано с тем, что DUE-B гомологичны между видами. [3] Например, если DUE-B в яйцеклетке Xenopus мутирует, репликация ДНК не произойдет, но может быть восстановлена путем добавления HeLa DUE-B для восстановления полной функциональности. [3]