В биохимии нуклеаза (также архаично известная как нуклеодеполимераза или полинуклеотидаза ) — фермент , способный расщеплять фосфодиэфирные связи между нуклеотидами нуклеиновых кислот . Нуклеазы по-разному вызывают одно- и двухцепочечные разрывы в молекулах-мишенях. В живых организмах они являются важным механизмом для многих аспектов восстановления ДНК . Дефекты некоторых нуклеаз могут вызвать генетическую нестабильность или иммунодефицит . [1] Нуклеазы также широко используются в молекулярном клонировании . [2]
Существует две основные классификации, основанные на локусе активности. Экзонуклеазы переваривают нуклеиновые кислоты с концов. Эндонуклеазы действуют на области в середине молекул-мишеней. Их подразделяют на дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы . Первый действует на ДНК , второй на РНК . [2]
В конце 1960-х годов ученые Стюарт Линн и Вернер Арбер выделили примеры двух типов ферментов, ответственных за ограничение роста фагов в бактериях Escherichia coli ( E. coli ). [3] [4] Один из этих ферментов добавлял метильную группу к ДНК, создавая метилированную ДНК , в то время как другой расщеплял неметилированную ДНК в самых разных местах по длине молекулы. Первый тип фермента был назван « метилазой », а второй — « нуклеазой рестрикции ». Эти ферментативные инструменты были важны для учёных, которые собирали инструменты, необходимые для « разрезания и вставки » молекул ДНК. Тогда нужен был инструмент, который разрезал бы ДНК в определенных участках, а не в случайных участках по длине молекулы, чтобы ученые могли разрезать молекулы ДНК предсказуемым и воспроизводимым способом.
Важным событием стало то, что Х. О. Смит , К. Уилкокс и Т. Дж. Келли , работавшие в Университете Джонса Хопкинса в 1968 году, выделили и охарактеризовали первую нуклеазу рестрикции , функционирование которой зависело от специфической нуклеотидной последовательности ДНК. Работая с бактериями Haemophilus influenzae , эта группа выделила фермент HindII, который всегда разрезает молекулы ДНК в определенной точке определенной последовательности из шести пар оснований. Они обнаружили, что фермент Hind II всегда разрезает непосредственно в центре этой последовательности (между 3-й и 4-й парами оснований).
Большинство нуклеаз классифицируются по номеру ферментной комиссии «Номенклатурного комитета Международного союза биохимии и молекулярной биологии » как гидролазы (EC-номер 3). Нуклеазы, как и фосфодиэстераза , липаза и фосфатаза, относятся к эстеразам (номер ЕС 3.1), подгруппе гидролаз. Эстеразы, к которым принадлежат нуклеазы, классифицируются с номерами ЕС 3.1.11 - Номер ЕС 3.1.31.
Первичная структура нуклеазы в целом плохо консервативна и минимально консервативна в активных центрах, поверхность которых в основном состоит из кислых и основных аминокислотных остатков. Нуклеазы можно разделить на складные семейства. [5]
Нуклеаза должна связаться с нуклеиновой кислотой, прежде чем она сможет расщепить молекулу. Это влечет за собой определенную степень признания. Нуклеазы по-разному используют как неспецифические, так и специфические ассоциации в своих способах узнавания и связывания. Оба режима играют важную роль в живых организмах, особенно в репарации ДНК. [7]
Неспецифические эндонуклеазы, участвующие в репарации ДНК, могут сканировать ДНК на предмет целевых последовательностей или повреждений . Такая нуклеаза диффундирует вдоль ДНК до тех пор, пока не встретит мишень, при которой остатки ее активного центра взаимодействуют с химическими группами ДНК. В случае эндонуклеаз, таких как EcoRV , BamHI и PvuII, это неспецифическое связывание включает электростатические взаимодействия между минимальной площадью поверхности белка и ДНК. Эта слабая ассоциация оставляет общую форму ДНК недеформированной, оставаясь в B-форме . [7]
Асайт-специфическая нуклеаза, напротив, образует гораздо более сильные ассоциации. Он втягивает ДНК в глубокую бороздку своего ДНК-связывающего домена . Это приводит к значительной деформации третичной структуры ДНКи достигается за счет поверхности, богатой основными (положительно заряженными) остатками. Он участвует в обширном электростатическом взаимодействии с ДНК. [7]
Некоторые нуклеазы, участвующие в репарации ДНК, обладают частичной специфичностью последовательности. Однако большинство из них неспецифичны и вместо этого распознают структурные аномалии, возникающие в основной цепи ДНК из-за несоответствия пар оснований . [7]
Подробнее см. лоскутную эндонуклеазу .
С момента первого открытия Hind II из более чем 230 штаммов бактерий было выделено более 900 рестриктаз, некоторые из которых специфичны по последовательности, а некоторые нет. Эти ферменты рестрикции обычно имеют названия, отражающие их происхождение: первая буква названия происходит от рода, а две вторые буквы — от вида прокариотической клетки, из которой они были выделены. Например, Eco RI происходит от бактерий Escherichia coli RY13, а HindII происходит от штамма Haemophilus influenzae Rd. Цифры после названий нуклеаз указывают порядок выделения ферментов из отдельных штаммов бактерий : EcoRI , EcoRII .
Эндонуклеаза рестрикции действует путем «сканирования» длины молекулы ДНК. Как только он встретит свою конкретную специфическую последовательность узнавания, он свяжется с молекулой ДНК и сделает по одному разрезу в каждом из двух сахарофосфатных остовов. Положения этих двух разрезов как по отношению друг к другу, так и к самой последовательности узнавания определяются идентичностью эндонуклеазы рестрикции. Разные эндонуклеазы производят разные наборы разрезов, но одна эндонуклеаза всегда разрезает определенную последовательность оснований одинаково, независимо от того, на какую молекулу ДНК она действует. После того, как разрезы будут сделаны, молекула ДНК разобьется на фрагменты.
Не все эндонуклеазы рестрикции разрезают симметрично и оставляют тупые концы, как Hind II, описанный выше. Многие эндонуклеазы расщепляют остовы ДНК в положениях, которые не находятся прямо напротив друг друга, создавая выступы. Например, нуклеаза EcoRI имеет последовательность узнавания 5'—GAATTC—3'.
Когда фермент встречает эту последовательность, он расщепляет каждый остов между G и ближайшими остатками оснований A. После того как разрезы сделаны, полученные фрагменты удерживаются вместе только относительно слабыми водородными связями, которые удерживают комплементарные основания друг с другом. Слабость этих связей позволяет фрагментам ДНК отделяться друг от друга. Каждый полученный фрагмент имеет выступающий 5'-конец, состоящий из неспаренных оснований. Другие ферменты создают разрезы в остове ДНК, что приводит к выступанию 3'-концов. Выступающие концы — как 3’, так и 5’ — иногда называют « липкими концами », поскольку они имеют тенденцию связываться с комплементарными последовательностями оснований. Другими словами, если непарная длина оснований 5'—AATT—3'встретит другую непарную длину с последовательностью, 3'—TTAA—5'они будут связываться друг с другом - они «липкие» друг для друга. Затем фермент лигаза используется для соединения фосфатных остовов двух молекул. Клеточное или даже видовое происхождение липких концов не влияет на их липкость. Любая пара комплементарных последовательностей будет иметь тенденцию к соединению, даже если одна из последовательностей происходит из участка человеческой ДНК, а другая — из участка бактериальной ДНК. Фактически, именно это качество липкости позволяет производить молекулы рекомбинантной ДНК, молекулы, состоящие из ДНК из разных источников, и породило технологию генной инженерии .
Поскольку все клетки зависят от ДНК как носителя генетической информации, генетический контроль качества является важной функцией всех организмов. Репликация ДНК — это процесс, подверженный ошибкам, а сами молекулы ДНК уязвимы к модификации многими метаболическими и экологическими стрессорами. Повсеместные примеры включают активные формы кислорода , ближний ультрафиолет и ионизирующее излучение . Многие нуклеазы участвуют в репарации ДНК, распознавая участки повреждения и отщепляя их от окружающей ДНК. Эти ферменты функционируют независимо или в комплексах . Большинство нуклеаз, участвующих в репарации ДНК, не являются специфичными для последовательности. Они распознают места повреждения посредством деформации вторичной структуры двухцепочечной ДНК (дцДНК). [5]
Во время репликации ДНК ДНК-полимеразы удлиняют новые цепи ДНК по отношению к комплементарным нитям матрицы. Большинство ДНК-полимераз содержат два разных ферментативных домена : полимеразу и корректирующую экзонуклеазу . Полимераза удлиняет новую цепь в направлении 5' → 3'. Экзонуклеаза удаляет ошибочные нуклеотиды из одной и той же цепи в направлении 3' → 5'. Эта экзонуклеазная активность необходима для способности ДНК-полимеразы корректировать текст. Делеции , инактивирующие или удаляющие эти нуклеазы, увеличивают уровень мутаций и смертности пораженных микробов и рака у мышей. [8]
Многие формы повреждений ДНК останавливают развитие репликационной вилки , заставляя ДНК-полимеразы и связанные с ней механизмы покидать вилку. Затем он должен быть обработан белками, специфичными для вилки. Наиболее примечательным является MUS81 . Делеции которых вызывают у дрожжей чувствительность к повреждению УФ-излучением или метилированием в дополнение к мейотическим дефектам. [5]
Повсеместной задачей в клетках является удаление праймеров РНК фрагмента Окадзаки из репликации. Большинство таких праймеров вырезаются из вновь синтезированной отстающей цепи ДНК эндонуклеазами семейства РНКаз Н. У эукариот и архей лоскутная эндонуклеаза FEN1 также участвует в процессинге фрагментов Оказаки. [5]
Репарация несоответствия ДНК в любом организме осуществляется с помощью набора эндонуклеаз, специфичных для несоответствия ДНК. У прокариот эту роль в первую очередь выполняют MutSLH и белки, связанные с репарацией очень коротких участков (восстановление VSP).
Система MutSLH (включающая MutS , MutL и MutH) исправляет точечные мутации и небольшие повороты . MutS распознает несовпадения и связывается с ними, привлекая MutL и MutH. MutL опосредует взаимодействие MutS и MutH и усиливает эндонуклеазную активность последнего. MutH распознает гемиметилированные 5'—GATC—3'сайты и расщепляется рядом с Gнеметилированной цепью (недавно синтезированной цепью).
Репарация VSP инициируется эндонуклеазой Vsr. Он исправляет специфическое несоответствие ,T/G вызванное спонтанным дезаминированием метилированных цитозинов в тимины. Vsr распознает последовательность , где он разрезает цепь ДНК на 5'-стороне несовпадающего тимина (подчеркнуто в предыдущей последовательности). Одна из экзонуклеаз RecJ, ExoVII или ExoI затем разрушает сайт, прежде чем ДНК-полимераза повторно синтезирует разрыв в цепи. [5]5'—CTWGG—3'
Формирование AP-сайта является обычным явлением в дцДНК. Это результат спонтанного гидролиза и активности ДНК-гликозилаз как промежуточного этапа эксцизионной репарации оснований . Эти AP-сайты удаляются AP-эндонуклеазами , которые вызывают одноцепочечные разрывы вокруг сайта. [5]
Эксцизионная репарация нуклеотидов , не путать с эксцизионной репарацией оснований, включает удаление и замену поврежденных нуклеотидов. Случаи сшивки , аддуктов и повреждений (вызванных ультрафиолетовым светом или активными формами кислорода ) могут запустить этот путь восстановления. Короткие участки одноцепочечной ДНК, содержащие такой поврежденный нуклеотид, удаляются из дуплексной ДНК отдельными эндонуклеазами, производящими надрезы выше и ниже места повреждения. Делеции или мутации, влияющие на эти нуклеазы, вызывают повышенную чувствительность к ультрафиолетовому повреждению и канцерогенезу. Такие аномалии могут даже препятствовать развитию нервной системы.
У бактерий оба разреза выполняются комплексом UvrB-UvrC . У почкующихся дрожжей Rad2 и комплекс Rad1-Rad10 образуют 5'- и 3'-разрезы соответственно. У млекопитающих гомологи XPG и XPF - ERCC1 влияют на одни и те же соответствующие разрывы. [9]
В клетках регулярно происходят двухцепочечные разрывы , как преднамеренные, так и непреднамеренные. Непреднамеренные разрывы обычно вызываются ионизирующим излучением , различными экзогенными и эндогенными химическими агентами и остановкой репликационных вилок. Преднамеренные разрывы генерируются как посредники в мейозе и рекомбинации V(D)J , которые в первую очередь восстанавливаются посредством гомологичной рекомбинации и негомологичного соединения концов . В обоих случаях концы двухцепочечных разрывов должны быть обработаны нуклеазами, прежде чем произойдет восстановление. Одной из таких нуклеаз является Mre11, образующая комплекс с Rad50 . Мутации Mre11 могут спровоцировать расстройство, подобное атаксии-телеангиэктазии . [9]
Рекомбинация V(D)J включает открытие структур «стебель-петля» , связанных с двухцепочечными разрывами, и последующее соединение обоих концов. В этой реакции участвует комплекс Артемида -ДНАПК cs . Хотя Artemis в одиночку проявляет экзонуклеазную активность 5' → 3' оцДНК, ее комплексообразование с DNA-PK cs позволяет осуществлять эндонуклеазный процессинг стебельных петель. Дефекты любого белка приводят к тяжелому иммунодефициту. [9]
С другой стороны, гомологичная рекомбинация включает два гомологичных дуплекса ДНК, соединенных D-петлями или соединениями Холлидея . У бактерий эндонуклеазы, такие как RuvC, разделяют соединения Холлидея на две отдельные дцДНК, расщепляя соединения в двух симметричных участках вблизи центра соединения. У эукариот FEN1 , XPF - ERCC1 и MUS81 расщепляют D-петли, а Cce1 / Ydc2 процессирует соединения Холлидея в митохондриях. [9]
Частота, с которой конкретная нуклеаза разрезает данную молекулу ДНК, зависит от сложности ДНК и длины последовательности распознавания нуклеазы; из-за статистической вероятности случайного обнаружения оснований в определенном порядке более длинная последовательность распознавания приведет к менее частому перевариванию. Например, можно предсказать, что данная последовательность из четырех оснований (соответствующая сайту узнавания гипотетической нуклеазы) будет встречаться в среднем каждые 256 пар оснований (где 4^4 = 256), но ожидается, что любая данная последовательность из шести оснований будет происходить в среднем один раз на каждые 4096 пар оснований (4^6=4096).
Одним из уникальных семейств нуклеаз являются мегануклеазы , которые характеризуются наличием более крупных и, следовательно, менее распространенных последовательностей распознавания, состоящих из 12–40 пар оснований. Эти нуклеазы особенно полезны для генной инженерии и геномной инженерии в сложных организмах, таких как растения и млекопитающие, где обычно более крупные геномы (насчитывающие миллиарды пар оснований) приводят к частому и вредному сайт-специфическому расщеплению с использованием традиционных нуклеаз.
