stringtranslate.com

β-галактозидаза

β-галактозидаза (EC 3.2.1.23, лактаза , бета-гал или β-гал ; систематическое название β- D -галактозидгалактогидролаза ), представляет собой фермент гликозидгидролазу , который катализирует гидролиз концевых невосстанавливающих остатков β- D -галактозы в β. - D -галактозиды.

β-галактозиды включают углеводы, содержащие галактозу , где гликозидная связь находится над молекулой галактозы. Субстраты различных β-галактозидаз включают ганглиозид GM1, лактозилцерамиды, лактозу и различные гликопротеины . [1]

Функция

β-галактозидаза представляет собой экзогликозидазу , которая гидролизует β- гликозидную связь , образующуюся между галактозой и ее органической частью. Он также может расщеплять фукозиды и арабинозиды , но с гораздо меньшей эффективностью. Это важный фермент в организме человека. Дефицит белка может привести к галактосиалидозу или синдрому Моркио B. В E. coli ген lacZ является структурным геном β-галактозидазы; который присутствует как часть lac- оперона индуцибельной системы , который активируется в присутствии лактозы при низком уровне глюкозы . Синтез β-галактозидазы прекращается, когда уровень глюкозы становится достаточным. [2]

β-галактозидаза имеет множество гомологов , основанных на схожих последовательностях. Некоторые из них выделяют β-галактозидазу (EBG), β-глюкозидазу , 6-фосфо-β-галактозидазу, β-маннозидазу и лактазо-флоризингидролазу. Хотя они могут быть структурно похожими, все они имеют разные функции. [3] Бета-гал ингибируется L -рибозой и конкурентными ингибиторами 2-фенилэтил-1-тио-β- D -галактопиранозидом (PETG), D -галактонолактоном, изопропилтио-β- D -галактозидом (IPTG) и галактозой. . [4]

β-галактозидаза важна для организмов, поскольку она является ключевым поставщиком энергии и источником углерода за счет расщепления лактозы до галактозы и глюкозы. Это также важно для сообщества людей с непереносимостью лактозы , поскольку оно отвечает за производство безлактозного молока и других молочных продуктов. У многих взрослых людей отсутствует фермент лактаза , который выполняет ту же функцию, что и β-галактозидаза, поэтому они не могут правильно переваривать молочные продукты. β-галактоза используется в таких молочных продуктах, как йогурт, сметана и некоторые сыры, которые обрабатываются ферментом для расщепления лактозы перед употреблением в пищу человеком. В последние годы β-галактозидаза исследовалась как потенциальное средство лечения непереносимости лактозы посредством заместительной генной терапии, при которой ее можно было бы поместить в ДНК человека, чтобы люди могли расщеплять лактозу самостоятельно. [5] [6]

Состав

1023 аминокислоты β-галактозидазы E. coli были секвенированы в 1983 году [7] , а ее структура определена одиннадцать лет спустя, в 1994 году. Белок представляет собой гомотетрамер массой 464 кДа с 2,2,2-точечной симметрией . [8] Каждая единица β-галактозидазы состоит из пяти доменов ; домен 1 представляет собой β-цилиндр типа желейного рулона , домены 2 и 4 представляют собой стволы, подобные фибронектину типа III , домен 5 представляет собой новый β-сэндвич, а центральный домен 3 представляет собой искаженный ствол типа TIM , лишенный пятой спирали с искажение в шестой нити. [8]

Третий домен содержит активный сайт. [9] Активный центр состоит из элементов двух субъединиц тетрамера, а диссоциация тетрамера на димеры удаляет критические элементы активного сайта. Аминоконцевая последовательность β-галактозидазы, α-пептида, участвующего в α-комплементации, участвует в интерфейсе субъединиц. Его остатки 22–31 помогают стабилизировать четырехспиральный пучок, который образует основную часть этого интерфейса, а остатки 13 и 15 также вносят вклад в активирующий интерфейс. Эти структурные особенности служат объяснением феномена α-комплементации, при котором удаление аминоконцевого сегмента приводит к образованию неактивного димера.

Реакция

β-галактозидазная реакция

β-галактозидаза может катализировать три различные реакции в организмах. В одном из них он может пройти процесс, называемый трансгалактозилированием, с образованием аллолактозы , создавая петлю положительной обратной связи для производства β-галактозы. Аллолактоза также может расщепляться с образованием моносахаридов. Он также может гидролизовать лактозу до галактозы и глюкозы , которые переходят в гликолиз . [3] Активный центр β-галактозидазы катализирует гидролиз ее дисахаридного субстрата посредством «мелкого» (непродуктивный сайт) и «глубокого» (продуктивный сайт) связывания. Галактозиды , такие как PETG и IPTG, будут связываться в поверхностном участке, когда фермент находится в «открытой» конформации, тогда как аналоги переходного состояния, такие как L -рибоза и D -галактонолактон, будут связываться в глубоком участке, когда конформация «закрыта». [4]

Ферментативная реакция состоит из двух химических стадий: галактозилирования и дегалактозилирования. Галактозилирование — это первая химическая стадия реакции, в которой Glu461 отдает протон гликозидному кислороду, в результате чего галактоза ковалентно связывается с Glu537. На втором этапе, дегалактозилировании, ковалентная связь разрывается, когда Glu461 принимает протон, заменяя галактозу водой. Во время реакции в глубоком участке фермента возникают два переходных состояния , один раз после каждой стадии. При участии воды в реакции образуется галактоза, в противном случае, когда акцептором на втором этапе выступает D -глюкоза, происходит трансгалактозилирование. [4] Кинетически измерено, что отдельные тетрамеры белка катализируют реакции со скоростью 38 500 ± 900 реакций в минуту. [10] Одновалентные ионы калия (K + ), а также двухвалентные ионы магния (Mg 2+ ) необходимы для оптимальной активности фермента. β-связь субстрата расщепляется концевой карбоксильной группой боковой цепи глутаминовой кислоты .

Изображение слева представляет собой ленточную диаграмму бета-галактозидазы, показывающую расположение Glu 461, Glu 537 и Gly 794. Изображение справа представляет собой увеличенную версию, показывающую взаимодействие между аминокислотами.

Считалось, что в E. coli Glu-461 является нуклеофилом в реакции замещения . [11] Однако теперь известно, что Glu-461 является кислотным катализатором. Вместо этого Glu-537 является настоящим нуклеофилом, [12] связывающимся с галактозильным промежуточным соединением. У человека нуклеофилом реакции гидролиза является Glu-268. [13] Gly794 важен для активности β-галактозидазы. Он отвечает за перевод фермента в «закрытую», связанную с лигандом конформацию или «открытую» конформацию, действуя как «шарнир» для петли активного центра. Различные конформации гарантируют, что в активном сайте происходит только предпочтительное связывание. В присутствии медленного субстрата активность Gly794 возрастала, а также увеличивалось галактозилирование и снижалось дегалактозилирование. [4]

Приложения

Анализ β-галактозидазы часто используется в генетике , молекулярной биологии и других науках о жизни . [14] Активный фермент можно обнаружить с помощью искусственного хромогенного субстрата 5-бром-4-хлор-3-индолил-β- D -галактопиранозида, X-гал . β-галактозидаза расщепляет гликозидную связь в X-гал и образует галактозу и 5-бром-4-хлор-3-гидроксииндол, которые димеризуются и окисляются до 5,5'-дибром-4,4'-дихлор-индиго, образуя интенсивный синий продукт, который легко идентифицировать и количественно оценить. [15] Используется, например, в сине-белом экране . [16] Его продукция может быть индуцирована негидролизуемым аналогом аллолактозы , IPTG , который связывает и высвобождает lac-репрессор из lac-оператора, тем самым позволяя продолжить инициацию транскрипции .

Он обычно используется в молекулярной биологии в качестве репортерного маркера для мониторинга экспрессии генов. Он также демонстрирует явление, называемое α-комплементацией, которое лежит в основе сине-белого скрининга рекомбинантных клонов. Этот фермент можно разделить на два пептида, LacZα и LacZΩ , ни один из которых не активен сам по себе, но когда оба присутствуют вместе, они спонтанно собираются в функциональный фермент. Это свойство используется во многих векторах клонирования , где присутствие гена lacZα в плазмиде может комплементировать в транс другой мутантный ген, кодирующий LacZΩ в конкретных лабораторных штаммах E. coli . Однако когда фрагменты ДНК встраиваются в вектор, продукция LacZα нарушается, поэтому клетки не проявляют активности β-галактозидазы. Присутствие или отсутствие активной β-галактозидазы можно обнаружить с помощью X-gal , который при расщеплении β-галактозидазой дает характерный синий краситель, тем самым обеспечивая простой способ различения присутствия или отсутствия клонированного продукта в плазмиде. В исследованиях хромосомных транслокаций при лейкозе Добсон и его коллеги использовали слитый белок LacZ у мышей [17] , используя склонность β-галактозидазы к олигомеризации, чтобы предположить потенциальную роль олигомерности в функции слитого белка MLL. [18]

Недавнее исследование, проведенное в 2020–2021 годах, показало, что активность бета-галактозидазы коррелирует со старением клеток. Старение клеток можно интерпретировать как клетки, которые не делятся, но не умирают. Активность бета-галактозидазы может быть сверхэкспрессированной, что может привести к различным заболеваниям, поражающим широкий спектр систем организма. К этим системам относятся сердечно-сосудистая система, скелетная система и многие другие. Обнаружение стареющих клеток может быть достигнуто путем измерения активности лизосомальной бета-галактозидазы. [19]

Новая изоформа бета-галактозидазы с оптимальной активностью при pH 6,0 (связанная со старением бета-гал или SA-бета-гал ) [20] , которая специфически выражается в старении (необратимой остановке роста клеток). Для его обнаружения даже были разработаны специальные количественные анализы. [21] [15] [22] Однако теперь известно, что это происходит из-за сверхэкспрессии и накопления лизосомальной эндогенной бета-галактозидазы, [23] и ее экспрессия не требуется для старения. Тем не менее, он остается наиболее широко используемым биомаркером стареющих и стареющих клеток, поскольку он надежен и легко обнаруживается.

Эволюция

Некоторые виды бактерий, включая E. coli , имеют дополнительные гены β-галактозидазы. Второй ген, названный геном развитой β-галактозидазы ( ebgA ), был обнаружен, когда штаммы с удаленным геном lacZ (но все еще содержащими ген галактозидпермеазы, lacY ) были высеяны на среду, содержащую лактозу (или другие 3-галактозиды) в качестве единственного вещества. источник углерода. Через некоторое время некоторые колонии начали расти. Однако белок EbgA является неэффективной лактазой и не позволяет расти на лактозе. Два класса одноточечных мутаций резко улучшают активность фермента ebg по отношению к лактозе. [24] [25] и, как следствие, мутантный фермент способен заменить lacZ β-галактозидазу. [26] EbgA и LacZ идентичны на 50% на уровне ДНК и на 33% на уровне аминокислот. [27] Активный фермент ebg представляет собой совокупность продуктов гена ebgA и гена ebgC в соотношении 1:1, при этом активная форма ферментов ebg представляет собой гетерооктамер α 4 β4 . [28]

Распространение видов

Большая часть работ, проделанных в области β-галактозидазы, получена из E. coli. Однако фермент можно найти во многих растениях (особенно во фруктах), млекопитающих, дрожжах, бактериях и грибах. [29] Гены β-галактозидазы могут различаться по длине кодирующей последовательности и длине белков, образованных аминокислотами. [30] Это разделяет β-галактозидазы на четыре семейства: GHF-1, GHF-2, GHF-35 и GHF-42. [31] E. Coli принадлежит к GHF-2, все растения принадлежат к GHF-35, и Thermus thermophilus принадлежит к GHF-42. [31] [30] Различные фрукты могут экспрессировать несколько генов β-галактозидазы. Существует по крайней мере семь генов β-галактозидазы, экспрессируемых в развитии плодов томата, аминокислотное сходство которых составляет от 33% до 79%. [32] Исследование, направленное на выявление размягчения плодов персиков, выявило 17 различных экспрессий генов β-галактозидаз. [30] Единственная другая известная кристаллическая структура β-галактозидазы принадлежит Thermus thermophilus . [31]

Рекомендации

  1. ^ Иллюстрированный медицинский словарь Дорланда. Архивировано из оригинала 16 октября 2006 г. Проверено 22 октября 2006 г.
  2. ^ Гарретт Р. (2013). Биохимия . Бельмонт, Калифорния: Cengage Learning. п. 1001. ИСБН 978-1133106296.
  3. ^ ab «Гликозидгидролаза, семейство 1, β-глюкозидаза (IPR017736) <InterPro <EMBL-EBI». www.ebi.ac.uk. _ Проверено 11 декабря 2015 г.
  4. ^ abcd Juers DH, Hakda S, Matthews BW, Huber RE (ноябрь 2003 г.). «Структурная основа измененной активности вариантов Gly794 β-галактозидазы Escherichia coli ». Биохимия . 42 (46): 13505–11. дои : 10.1021/bi035506j. ПМИД  14621996.
  5. ^ Салехи С., Экли Л., Сойер Г.Дж., Чжан X, Донг X, Фройнд Дж.Н., Фабр Дж.В. (январь 2009 г.). «Кишечная лактаза как аутологичный репортерный ген β-галактозидазы для исследований экспрессии генов in vivo». Генная терапия человека . 20 (1): 21–30. дои : 10.1089/hum.2008.101. ПМИД  20377368.
  6. ^ Исикава К., Катаока М., Янамото Т., Накабаяши М., Ватанабэ М., Исихара С., Ямагути С. (июль 2015 г.). «Кристаллическая структура β-галактозидазы из Bacillus circulans ATCC 31382 (BgaD) и конструирование термофильных мутантов». Журнал ФЭБС . 282 (13): 2540–52. дои : 10.1111/февраль 13298 . PMID  25879162. S2CID  33928719.
  7. ^ Калниньш А, Отто К, Рютер У, Мюллер-Хилл Б (1983). «Последовательность гена lacZ Escherichia coli». Журнал ЭМБО . 2 (4): 593–7. doi :10.1002/j.1460-2075.1983.tb01468.x. ПМК 555066 . ПМИД  6313347. 
  8. ^ Аб Джейкобсон Р.Х., Чжан XJ, ДюБоз Р.Ф., Мэтьюз Б.В. (июнь 1994 г.). «Трехмерная структура β-галактозидазы E. coli ». Природа . 369 (6483): 761–6. Бибкод : 1994Natur.369..761J. дои : 10.1038/369761a0. PMID  8008071. S2CID  4241867.
  9. ^ Мэтьюз BW (июнь 2005 г.). «Строение β-галактозидазы E. coli». Comptes Rendus Biologies . 328 (6): 549–56. doi :10.1016/j.crvi.2005.03.006. ПМИД  15950161.
  10. ^ Джуерс Д.Х., Мэтьюз Б.В., Хубер Р.Э. (декабрь 2012 г.). «LacZ β-галактозидаза: структура и функция фермента исторического и молекулярно-биологического значения». Белковая наука . 21 (12): 1792–807. дои : 10.1002/pro.2165. ПМЦ 3575911 . ПМИД  23011886. 
  11. ^ Геблер Дж.К., Эберсольд Р., Уизерс С.Г. (июнь 1992 г.). «Glu-537, а не Glu-461, является нуклеофилом в активном центре (lac Z) β-галактозидазы из Escherichia coli». Журнал биологической химии . 267 (16): 11126–30. дои : 10.1016/S0021-9258(19)49884-0 . ПМИД  1350782.
  12. ^ Юань Дж., Мартинес-Бильбао М., Хубер Р.Э. (апрель 1994 г.). «Замены Glu-537 β-галактозидазы из Escherichia coli вызывают значительное снижение каталитической активности». Биохимический журнал . 299 (Часть 2): 527–31. дои : 10.1042/bj2990527. ПМЦ 1138303 . ПМИД  7909660. 
  13. ^ Маккартер Дж. Д., Бургойн Д. Л., Мяо С., Чжан С., Каллахан Дж. В., Уизерс С. Г. (январь 1997 г.). «Идентификация Glu-268 как каталитического нуклеофила предшественника лизосомальной β-галактозидазы человека методом масс-спектрометрии» (PDF) . Журнал биологической химии . 272 (1): 396–400. дои : 10.1074/jbc.272.1.396 . PMID  8995274. S2CID  35101194.
  14. ^ Нинфа AJ, Ballou DP (2009). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . ISBN 978-0-470-47131-9.
  15. ^ ab Гэри РК, Кинделл С.М. (август 2005 г.). «Количественный анализ активности бета-галактозидазы, связанной со старением, в экстрактах клеток млекопитающих». Аналитическая биохимия . 343 (2): 329–34. дои : 10.1016/j.ab.2005.06.003. ПМИД  16004951.
  16. ^ Анализ β-галактозидазы (лучший Миллер) - OpenWetWare
  17. ^ Добсон CL, Уоррен А.Дж., Паннелл Р., Форстер А., Rabbitts TH (март 2000 г.). «Онкогенез у мышей при слиянии онкогена лейкемии Mll и бактериального гена lacZ». Журнал ЭМБО . 19 (5): 843–51. дои : 10.1093/emboj/19.5.843. ПМК 305624 . ПМИД  10698926. 
  18. ^ Кривцов А.В., Армстронг С.А. (ноябрь 2007 г.). «Транслокации MLL, модификации гистонов и развитие стволовых клеток лейкемии». Обзоры природы. Рак . 7 (11): 823–33. дои : 10.1038/nrc2253. PMID  17957188. S2CID  9183717.
  19. ^ Лозано-Торрес, Беатрис; Бландез, Хуан Ф.; Сансенон, Феликс; Мартинес-Маньес, Рамон (апрель 2021 г.). «Хромофлуорогенные зонды для обнаружения β-галактозидазы». Аналитическая и биоаналитическая химия . 413 (9): 2361–2388. дои : 10.1007/s00216-020-03111-8. hdl : 10251/180327 . ISSN  1618-2642. PMID  33606064. S2CID  231957317.
  20. ^ Димри Г.П., Ли X, Базиль Дж., Акоста М., Скотт Дж., Роскелли С. и др. (сентябрь 1995 г.). «Биомаркер, который идентифицирует стареющие клетки человека в культуре и в стареющей коже in vivo». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 92 (20): 9363–7. Бибкод : 1995PNAS...92.9363D. дои : 10.1073/pnas.92.20.9363 . ПМК 40985 . ПМИД  7568133. 
  21. ^ Бассанезе В., Миякава А.А., Кригер Дж.Э. (январь 2008 г.). «Количественный хемилюминесцентный метод изучения репликативного и стресс-индуцированного преждевременного старения в клеточных культурах». Аналитическая биохимия . 372 (2): 198–203. дои : 10.1016/j.ab.2007.08.016. ПМИД  17920029.
  22. ^ Итахана К., Камписи Дж., Димри Г.П. (2007). «Методы обнаружения биомаркеров клеточного старения» . Биологическое старение . Методы молекулярной биологии. Том. 371. Хумана Пресс. стр. 21–31. дои : 10.1007/978-1-59745-361-5_3. ISBN 978-1-58829-658-0. ПМИД  17634571.
  23. ^ Ли БАЙ, Хан Дж.А., Им Дж.С., Морроне А., Джохунг К., Гудвин ЕС и др. (апрель 2006 г.). «β-галактозидаза, связанная со старением, представляет собой лизосомальную β-галактозидазу». Стареющая клетка . 5 (2): 187–95. дои : 10.1111/j.1474-9726.2006.00199.x. hdl : 2158/216175 . PMID  16626397. S2CID  82432911.
  24. ^ Холл Б.Г. (январь 1977 г.). «Количество мутаций, необходимых для развития новой функции лактазы в Escherichia coli». Журнал бактериологии . 129 (1): 540–3. дои : 10.1128/JB.129.1.540-543.1977. ПМК 234956 . ПМИД  318653. 
  25. ^ Холл Б.Г. (июль 1981 г.). «Изменения субстратных особенностей фермента при направленной эволюции новых функций». Биохимия . 20 (14): 4042–9. дои : 10.1021/bi00517a015. ПМИД  6793063.
  26. ^ Холл Б.Г. (октябрь 1976 г.). «Экспериментальная эволюция новой ферментативной функции. Кинетический анализ предков (ebg) и эволюционировавших (ebg) ферментов». Журнал молекулярной биологии . 107 (1): 71–84. дои : 10.1016/s0022-2836(76)80018-6. ПМИД  794482.
  27. ^ Стоукс Х.В., Беттс П.В., Холл Б.Г. (ноябрь 1985 г.). «Последовательность гена ebgA Escherichia coli: сравнение с геном lacZ». Молекулярная биология и эволюция . 2 (6): 469–77. doi : 10.1093/oxfordjournals.molbev.a040372 . ПМИД  3939707.
  28. ^ Эллиотт AC, KS, Синнотт ML, Смит П.Дж., Боммусвами Дж., Го З и др. (февраль 1992 г.). «Каталитические последствия экспериментальной эволюции. Исследования субъединичной структуры второй (ebg) β-галактозидазы Escherichia coli, а также катализа ebgab, экспериментального эволюционанта, содержащего две аминокислотные замены». Биохимический журнал . 282 (Часть 1) (1): 155–64. дои : 10.1042/bj2820155. ПМК 1130902 . ПМИД  1540130. 
  29. ^ Ричмонд М.Л., Грей Дж.И., Стайн С.М. (1981). «β-галактозидаза: обзор недавних исследований, связанных с технологическим применением, проблемами питания и иммобилизацией». Журнал молочной науки . 64 (9): 1759–1771. doi : 10.3168/jds.s0022-0302(81)82764-6 . ISSN  0022-0302.
  30. ^ abc Го С, Сун Дж, Чжан Б, Цзян Х, Ма Р, Ю М (2018). «Полногеномная идентификация и анализ экспрессии членов семейства β-галактозидаз во время размягчения плодов персика [ Prunus persica (L.) Batsch]». Послеуборочная биология и технология . 136 : 111–123. doi :10.1016/j.postharvbio.2017.10.005.
  31. ^ abc Рохас А.Л., Нагем Р.А., Неустроев К.Н., Аранд М., Адамска М., Енейская Е.В. и др. (ноябрь 2004 г.). «Кристаллические структуры β-галактозидазы Penicillium sp. и ее комплекса с галактозой». Журнал молекулярной биологии . 343 (5): 1281–92. дои : 10.1016/j.jmb.2004.09.012. ПМИД  15491613.
  32. ^ Смит Д.Л., Гросс К.К. (июль 2000 г.). «Семейство, состоящее как минимум из семи генов β-галактозидазы, экспрессируется во время развития плодов томата». Физиология растений . 123 (3): 1173–83. дои : 10.1104/стр.123.3.1173. ПМК 59080 . ПМИД  10889266. 

Внешние ссылки