Гены, активирующие рекомбинацию ( RAG), кодируют части белкового комплекса , который играет важную роль в перестройке и рекомбинации генов, кодирующих молекулы иммуноглобулина и рецептора Т-клеток . Существует два гена, активирующих рекомбинацию, RAG1 и RAG2 , клеточная экспрессия которых ограничена лимфоцитами на стадиях их развития. Ферменты, кодируемые этими генами, RAG-1 и RAG-2, необходимы для генерации зрелых В-клеток и Т-клеток , двух типов лимфоцитов, которые являются важнейшими компонентами адаптивной иммунной системы . [1]
В иммунной системе позвоночных каждое антитело настроено на атаку одного конкретного антигена (чужеродных белков и углеводов), не атакуя сам организм. Геном человека содержит не более 30 000 генов, и тем не менее он генерирует миллионы различных антител, что позволяет ему реагировать на вторжение миллионов различных антигенов. Иммунная система генерирует это разнообразие антител путем перетасовки, разрезания и рекомбинации нескольких сотен генов (генов VDJ) для создания миллионов перестановок в процессе, называемом рекомбинацией V(D)J . [1] RAG-1 и RAG-2 — это белки на концах генов VDJ, которые разделяют, перетасовывают и воссоединяют гены VDJ. Эта перетасовка происходит внутри В-клеток и Т-клеток во время их созревания.
Ферменты RAG работают как многосубъединичный комплекс, вызывая расщепление одной двухцепочечной молекулы ДНК (dsDNA) между сегментом, кодирующим рецептор антигена , и фланкирующей последовательностью сигнала рекомбинации (RSS). Они делают это в два этапа. Сначала они вводят «разрыв» в 5' (выше по течению) конец гептамера RSS (консервативная область из 7 нуклеотидов), который примыкает к кодирующей последовательности, оставляя после себя определенную биохимическую структуру в этом регионе ДНК: 3'- гидроксильную (OH) группу на кодирующем конце и 5'- фосфатную (PO 4 ) группу на конце RSS. Следующий этап соединяет эти химические группы, связывая OH-группу (на кодирующем конце) с PO 4 -группой (которая находится между RSS и сегментом гена на противоположной цепи). Это приводит к 5'-фосфорилированному двухцепочечному разрыву в RSS и ковалентно закрытой шпильке на кодирующем конце. Белки RAG остаются в этих соединениях до тех пор, пока другие ферменты (в частности, TDT) не исправят разрывы ДНК.
Белки RAG инициируют рекомбинацию V(D)J, которая необходима для созревания пре-B и пре-T клеток. Активированные зрелые B клетки также обладают двумя другими замечательными, независимыми от RAG явлениями манипулирования собственной ДНК: так называемой рекомбинацией с переключением класса (AKA переключением изотипа) и соматической гипермутацией (AKA созреванием сродства). [2] Текущие исследования показали, что RAG-1 и RAG-2 должны работать синергетически для активации рекомбинации VDJ . Было показано, что RAG-1 неэффективно индуцирует рекомбинационную активность генов VDJ при изоляции и трансфекции в образцы фибробластов. Когда RAG-1 был котрансфицирован с RAG-2, частота рекомбинации увеличилась в 1000 раз. [3] Это открытие способствовало новой пересмотренной теории о том, что гены RAG могут не только помогать в рекомбинации VDJ, но и напрямую индуцировать рекомбинации генов VDJ.
Как и многие ферменты, белки RAG довольно большие. Например, мышиный RAG-1 содержит 1040 аминокислот , а мышиный RAG-2 содержит 527 аминокислот. Ферментативная активность белков RAG сосредоточена в основном в центральной области; остатки 384–1008 RAG-1 и остатки 1–387 RAG-2 сохраняют большую часть активности расщепления ДНК. Ядро RAG-1 содержит три кислотных остатка (D 600 , D 708 и E 962 ) в так называемом мотиве DDE , основном активном сайте расщепления ДНК. Эти остатки имеют решающее значение для надреза цепи ДНК и формирования шпильки ДНК. Остатки 384–454 RAG-1 включают область связывания нонамера (NBR), которая специфически связывает консервативный нонамер (9 нуклеотидов ) RSS, а центральный домен (аминокислоты 528–760) RAG-1 специфически связывается с гептамером RSS. Предполагается, что основная область RAG-2 образует шестилопастную бета-пропеллерную структуру, которая, по-видимому, менее специфична, чем RAG-1 для своей цели.
Структуры синаптических комплексов RAG, полученные с помощью криоэлектронной микроскопии, выявляют закрытую димерную конформацию с образованием новых межмолекулярных взаимодействий между двумя мономерами RAG1-RAG2 при связывании ДНК по сравнению с комплексом Apo-RAG, который представляет собой открытую конформацию. [4] Обе молекулы RAG1 в закрытом димере участвуют в кооперативном связывании промежуточных продуктов 12-RSS и 23-RSS с взаимодействиями, специфичными для оснований, в гептамере сигнального конца. Первое основание гептамера в сигнальном конце вывернуто наружу, чтобы избежать столкновения в активном центре. Каждый кодирующий конец промежуточного продукта nicked-RSS стабилизирован исключительно одним мономером RAG1-RAG2 с неспецифическими взаимодействиями белок-ДНК. Кодирующий конец сильно искажен, при этом одно основание вывернуто из дуплекса ДНК в активном центре, что облегчает образование шпильки с помощью потенциального каталитического механизма с двумя ионами металлов. Промежуточные соединения 12-RSS и 23-RSS сильно изогнуты и асимметрично связаны с синаптическим комплексом RAG, при этом димер домена связывания нонамера наклонен к нонамеру 12-RSS, но от нонамера 23-RSS, что подчеркивает правило 12/23. Две молекулы HMGB1 связываются с каждой стороны 12-RSS и 23-RSS, чтобы стабилизировать сильно изогнутые RSS. Эти структуры разрабатывают молекулярные механизмы распознавания ДНК, катализа и уникального синапса, лежащего в основе правила 12/23, дают новое представление о заболеваниях человека, связанных с RAG, и представляют собой наиболее полный набор комплексов в каталитических путях любых рекомбиназ, транспозаз или интеграз семейства DDE.
На основании гомологии основных последовательностей считается, что RAG1 произошел от транспозазы из суперсемейства Transib . [5] Ни один из членов семейства Transib не включает N-концевую последовательность, обнаруженную в RAG1, что позволяет предположить, что N-конец RAG1 произошел от отдельного элемента. N-концевая область RAG1 была обнаружена в транспозируемом элементе N-RAG-TP у морского слизняка Aplysia californica , который содержит весь N-конец RAG1. [6] Вероятно, что полная структура RAG1 была получена в результате рекомбинации между Transib и транспозоном N-RAG-TP . [7]
Транспозон с RAG2, расположенным рядом с RAG1, был идентифицирован у пурпурного морского ежа. [8] Активные транспозоны Transib с RAG1 и RAG2 («ProtoRAG») были обнаружены у B. belcheri (китайский ланцетник) и Psectrotarsia flava (моль). [9] [10] Концевые инвертированные повторы (TIR) в ProtoRAG ланцетника имеют структуру гептамер-спейсер-нонамер, похожую на структуру RSS, но у ProtoRAG моли нет нонамера. Области связывания нонамера и последовательности нонамера ProtoRAG ланцетника и RAG животных достаточно различны, чтобы не распознавать друг друга. [9] Структура protoRAG ланцетника была решена ( PDB : 6b40 ), что дало некоторое представление о том, какие изменения приводят к одомашниванию генов RAG. [11]
Хотя происхождение этих генов от транспозонов хорошо известно, до сих пор нет единого мнения о том, когда предковый локус RAG1/2 появился в геноме позвоночных. Поскольку у бесчелюстных (класс бесчелюстных рыб) отсутствует основной элемент RAG1, традиционно предполагалось, что RAG1 вторгся после разделения бесчелюстных и челюстноротых 1001–590 миллионов лет назад (MYA). [12] Однако основная последовательность RAG1 была идентифицирована у иглокожих Strongylocentrotus purpuratus (фиолетовый морской еж), [13] у ланцетника Branchiostoma floridae (флоридский ланцетник). [14] Последовательности с гомологией с RAG1 также были идентифицированы у Lytechinus veriegatus (зеленый морской еж), Patiria minata (морская звезда), [8] моллюска Aplysia californica, [15] и первичноротых, включая устриц, мидий, ленточных червей и недвусторонних книдарий . [16] Эти результаты указывают на то, что транспозон семейства Transib многократно вторгался в беспозвоночные виды и вторгся в геном предковых челюстных позвоночных около 500 млн лет назад. [8] Предполагается, что отсутствие генов, подобных RAG, у бесчелюстных позвоночных и урохордовых [16] обусловлено горизонтальным переносом генов или потерей генов в определенных филогенетических группах из-за обычной вертикальной передачи. [13] Недавний анализ показал, что филогения RAG является постепенной и направленной, что предполагает эволюционный путь, который основан на вертикальной передаче. [16] Эта гипотеза предполагает, что пара, подобная RAG1/2, могла присутствовать в своей нынешней форме в большинстве линий метазоа и была утрачена в линиях бесчелюстных позвоночных и хордовых. [7] Нет никаких доказательств того, что система рекомбинации V(D)J возникла раньше, чем линия позвоночных. [7] В настоящее время предполагается, что вторжение RAG1/2 является наиболее важным эволюционным событием с точки зрения формирования адаптивной иммунной системы челюстноротых по сравнению с системой вариабельных лимфоцитарных рецепторов бесчелюстных .
До сих пор неясно, какие силы привели к развитию иммунной системы, опосредованной RAG1/2, исключительно у челюстных позвоночных, а не у каких-либо видов беспозвоночных, которые также приобрели транспозон, содержащий RAG1/2. Текущие гипотезы включают два события дупликации всего генома у позвоночных, [17] которые могли бы предоставить генетическое сырье для развития адаптивной иммунной системы, а также развитие эндотелиальной ткани, большую метаболическую активность и сниженное соотношение объема крови к массе тела, все из которых более специализированы у позвоночных, чем у беспозвоночных, и способствуют адаптивным иммунным реакциям. [18]