stringtranslate.com

карикаин

Карикаин ( EC 3.4.22.30, пептидаза папайи A , пептидаза папайи II , протеиназа папайи , протеиназа папайи III , протеиназа папайи 3 , протеиназа омега , протеиназа папайи A , химопапаин S , Pp ) — фермент . [ 1] [2] [3] [4] [5] [6] Этот фермент катализирует следующую химическую реакцию : гидролиз белков с широкой специфичностью к пептидным связям , подобной папаину и химопапаину.

Этот фермент выделен из растения папайи Carica papaya .

Имя и история

Первое описание этого фермента было предоставлено Шаком [1], который назвал его пептидазой папайи А. С тех пор этому ферменту было дано несколько разных названий, включая пептидазу папайи II, [4] протеиназу папайи III [5] и протеиназу папайи. [7] Название карикаин было рекомендовано NC-IUBMB в 1992 году.

Структурная химия

Карикаин синтезируется как препрофермент . На уровне мРНК имеются доказательства полиморфизма, были выделены два очень похожих клона, один из которых содержал C-концевое расширение. [8] Первичная структура зрелой формы фермента была определена, [9] и соответствует предсказанию одной из последовательностей кДНК . Длина белка составляет 216 аминокислот, и он на 68% идентичен последовательности папаину , на 65% химопапаину и на 81% глицилэндопептидазе . Три дисульфидные связи сохраняются между всеми протеиназами папайи, и нет никаких доказательств гликозилирования . Карикаин является чрезвычайно основным белком, его pI оценивается в 11,7. Сообщается, что A280,1% составляет 18,3, что дает молярный коэффициент экстинкции 4,193 104 М21 см21.

Как и некоторые другие растительные цистеиновые эндопептидазы , карикаин проявляет зарядовую гетерогенность. Это может быть отчасти обусловлено вариацией степени окисления серы активного центра, как в случае с гомологичными ферментами из стебля ананаса, хотя генетический полиморфизм также может вносить свой вклад.

Кристаллическая структура карикаина была решена с разрешением 1,8 A ̊ и демонстрирует конформацию основной цепи, очень похожую на таковую папаина. Карикаин имеет четыре аминокислотных остатка (Ser169-Lys172), которых нет в папаине , но именно папаин является исключительным в этой точке последовательности, показывая делецию, не наблюдаемую у других членов семейства. Архитектура активного центра карикаина очень похожа на таковую папаина.

Подготовка

Высокоосновный характер карикаина позволяет относительно легко отделить его от других цистеиновых эндопептидаз папайи в катионообменной хроматографии препаратов коммерчески доступного латекса папайи. Градиент ацетата натрия, pH 5,0, был впервые успешно использован Робинсоном [10] и с тех пор был принят другими. Карикаин обнаружен в пике белка, элюирующегося последним. Из-за зарядовой гетерогенности карикаина пик может быть несимметричным, но это не обязательно указывает на присутствие загрязняющих веществ. Ковалентная хроматография на тиол- сефарозе позволяет изолировать полностью активный карикаин из материала, полученного путем катионообмена. [11]

Активность и специфичность

Как и большинство ферментов семейства C1, карикаин принимает гидрофобные аминокислотные остатки как в S2, так и в S3. Однако другие остатки также размещаются в этих подсайтах, включая пролин в S2 и лизин в S3. [ 12] Было обнаружено, что специфичности трех цистеиновых эндопептидаз из латекса папайи очень похожи. Карикаин и химопапаин , по-видимому, предпочитают алифатический остаток гидрофобному в P2. Сходство специфичности карикаина и химопапаина было продемонстрировано тем фактом, что из 44 пептидных связей в гемоглобине ламантина, расщепляемых карикаином, 29 также расщеплялись химопапаином. [12] Более раннее исследование [13] подчеркнуло сходство специфичности карикаина, химопапаина и папаина. Все семь связей окисленной В-цепи инсулина, которые были гидролизованы карикаином, были также расщеплены папаином, а шесть были гидролизованы химопапаином.

Карикаин можно анализировать с Bz-ArgkNHPhNO2, kcat/Km составляет 187 M21 s21 при pH 6,8 и 40˚C. Более чувствительные субстраты могут использовать флуорометрическую уходящую группу, kcat/Km для гидролиза Z-Phe-ArgkNHMec составляет 1,06 3 106 M21 s21 (pH 6,8, 40˚C). [5] Фермент демонстрирует широкий профиль pH-активности с оптимумом около 7,0. Около половины максимальной активности все еще достигается при значениях pH около 5,3 и 8,3, и, как сообщается, профиль регулируется по крайней мере тремя ионизирующими группами. [14] Сера активного центра требует восстановления для каталитической компетентности, и это лучше всего достигается путем включения низких миллимолярных концентраций цистеина в аналитические буферы.

Карикаин инактивируется E-64, что делает ингибитор удобным титрантом активного центра, и он ингибируется цистатинами , причем Ki для ингибирования цистатином папайи составляет 1,5 нМ.

Соответствующая фармакокинетика

Структура прокарикаина показывает про-регион, соединенный с активным ферментом. [15] Карикаин рассматривается как цистеиновая эндопептидаза , то есть он функционирует посредством действия остатка цистеина в своем активном центре и способен гидролизовать пептидные связи, которые находятся в пределах N -конца и С-конца субстрата .

В случае проферментов фармакокинетика обычно регулируется скоростью внутримолекулярного расщепления для получения активной формы фермента. Каталитический сайт расположен в щели между двумя долями, и связывание субстрата должно произойти до того, как активность станет доступной. [16] Однако, поскольку активная форма — это та, которая присутствует в обработанном латексе, [17] этапом, ограничивающим скорость, в реакции с белками будет просто преобразование комплекса фермент-субстрат в продукт с регенерацией фермента. Однако гидролиз пептидной связи является автоматически благоприятной реакцией. [18] Протеолитические ферменты, такие как карикаин, катализируют гидролиз пептидной связи со скоростями, которые зависят от определенных химических групп аминокислот по соседству с этой связью. [19] Гидролиз обычно ограничивается пептидами, образованными из аминокислот L-конфигурации. Скорость изменяется линейно с низкой концентрацией субстрата (кинетика первого порядка) и становится независимой при высоких концентрациях субстрата ( кинетика нулевого порядка ).

Кинетика зависит от быстрого образования комплекса фермент-субстрат, который затем медленно преобразуется в продукт на этапе определения скорости, который регенерирует фермент. Когда концентрация фермента намного меньше концентрации субстрата, скорость реакции прямо пропорциональна общей концентрации фермента. Однако гидролиз пептидной связи является энергетически выгодной реакцией. [18]

Недавние эксперименты как с сырым карикаином, так и с очищенным карикаином показали, что реакция, которая контролирует детоксикацию переваренного глиадина пшеницы при pH 7,5 и 37 °C, действительно является реакцией 1-го порядка с константой скорости 1,7 x 10−4 сек. − 1 . [20] Скорость реакции сопровождалась исчезновением пептидов глиадина , которые были токсичны для лизосом печени крыс.

Использует

Расстройства, связанные с глютеном

Глютен - это структурный белок, который естественным образом содержится в некоторых злаковых культурах . В медицинской литературе глютеном называют комбинацию белков проламина и глютелина, которые естественным образом присутствуют во всех злаках и которые, как доказано, способны вызывать целиакию . Специфические иммуногенные пептиды в глиадине , классе белков, присутствующих в пшенице и некоторых других злаках , обладают способностью провоцировать аутоиммунную энтеропатию, вызванную аномальным иммунным ответом у генетически восприимчивых людей с целиакией и другими расстройствами, связанными с глютеном .

Ферментная терапия для расстройств, связанных с глютеном, предполагает использование высоконаправленных пролин- и глутамин -специфичных эндопротеаз для разрушения иммуногенных пептидов глютена до того, как они вступят во взаимодействие с кишечной оболочкой. Исследования in vitro [21] [20] продемонстрировали, что карикаин обеспечивает высокую степень защиты от токсического действия глиадина на лизосомы печени крыс и способен быстро переваривать ключевые иммунореактивные эпитопы глютена, связанные с патологией целиакии.

Ссылки

  1. ^ ab Schack P (1967). «Фракционирование протеолитических ферментов высушенного латекса папайи. Выделение и предварительная характеристика нового протеолитического фермента». Comptes Rendus des Travaux du Laboratoire Carlsberg . 36 (4): 67–83. PMID  6043136.
  2. ^ Robinson GW (август 1975). «Выделение и характеристика пептидазы папайи А из коммерческого химопапаина». Биохимия . 14 (16): 3695–700. doi :10.1021/bi00687a028. PMID  240390.
  3. ^ Полгар Л. (июль 1984 г.). «Проблемы классификации протеиназ латекса папайи». Биохимический журнал . 221 (2): 555–6. doi :10.1042/bj2210555. PMC 1144075. PMID  6383350 . 
  4. ^ ab Brocklehurst K, Salih E, McKee R, Smith H (июнь 1985 г.). «Свежий нефруктовый латекс Carica papaya содержит папаин, множественные формы химопапаина A и омега-протеиназу папайи». The Biochemical Journal . 228 (2): 525–7. doi :10.1042/bj2280525. PMC 1145013 . PMID  4015629. 
  5. ^ abc Zucker S, Buttle DJ, Nicklin MJ, Barrett AJ (апрель 1985). "Протеолитическая активность химопапаина, папаина и протеиназы папайи III". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Структура белка и молекулярная энзимология . 828 (2): 196–204. doi :10.1016/0167-4838(85)90057-3. PMID  3919769.
  6. ^ Dubois T, Kleinschmidt T, Schnek AG, Looze Y, Braunitzer G (август 1988). «Тиоловые протеиназы из латекса Carica papaya L. II. Первичная структура протеиназы омега». Биологическая химия Hoppe-Seyler . 369 (8): 741–54. doi :10.1515/bchm3.1988.369.2.741. PMID  3063283.
  7. ^ Brocklehurst, K., Salih, E., McKee, R., Smith, H. (1985). Свежий нефруктовый латекс Carica papaya содержит папаин, множественные формы химопапаина A и протеиназу папайи S. Biochem. J. 228, 525–527.
  8. ^ Revell, DF, Cummings, NJ, Baker, KC, Collins, ME, Taylor, MAJ, Sumner, IG, Pickersgill, RW, Connerton, IF, Goodenough, PW (1993). Нуклеотидная последовательность и экспрессия в Escherichia coli кДНК, кодирующих протеиназу папайи Ω из Carica papaya. Gene 127, 221–225.
  9. ^ Дюбуа, Т., Кляйншмидт, Т., Шнек, АГ, Лозе, И., Брауницер, Г. (1988). Тиоловые протеиназы Ω из латекса Carica papaya L. II. Первичная структура протеиназы. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369, 741–754.
  10. ^ Робинсон, Г. В. (1975). Выделение и характеристика пептидазы А папайи из коммерческого химопапаина. Биохимия 14, 3695–3700.
  11. ^ Дюбуа, Т., Жаке, А., Шнек, АГ, Лузе, И. (1988). Тиоловые протеиназы из латекса Carica papaya LI Фракционирование, очистка и предварительная характеристика. Biol. Chem. Hoppe- Seyler 369, 733–740.
  12. ^ ab Jacquet, A., Kleinschmidt, T., Dubois, T., Schnek, AG, Looze, Y., Braunitzer, G. (1989). Тиоловые протеиназы из латекса Carica papaya L. IV. Протеолитические специфичности химопапаина и Ω-протеиназы папайи, определяемые перевариванием α-глобиновых цепей. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 370, 819–829.
  13. ^ Йохансен, Дж. Т., Оттесен, М. (1968). Протеолитическая деградация B-цепи окисленного инсулина папаином, химопапаином и пептидазой папайи. Comptes Rendus Lab. Carlsberg 36, 265–283.
  14. ^ Taylor, MAJ, Baker, KC, Connerton, IF, Cummings, NJ, Harris, GW, Henderson, IMJ, Jones, ST, Pickersgill, RW, Sumner, IG, Warwicker, J., Goodenough, PW (1994). Недвусмысленный пример активности цистеиновой протеиназы, на которую влияют множественные электростатические взаимодействия. Protein Eng. 7, 1267–1276.
  15. ^ Groves, RH, Hosking, JR, Batianoff, GN, Cooke, DA, Cowie, ID, Johnson, RW, Keighery, GJ, Lepschi, BJ, Mitchell, AA, Moerkerk, M., Randall, RP, Rozefelds, AC, Walsh, NG, Waterhouse, BM (2003). Категории сорняков для управления природными и сельскохозяйственными экосистемами. Бюро сельских наук, Министерство сельского хозяйства, рыболовства и лесного хозяйства правительства Австралии, Канберра.
  16. ^ Пикерсгилл, Барбара. «Цитогенетика и эволюция Capsicum L.» Хромосомная инженерия растений: генетика, селекция, эволюция, часть B. Elsevier, Амстердам (1991): 139-160.
  17. ^ Азаркан М., Эль Муссауи А., Ван Вуйтсвинкель Д., Дехон Г. и Луз Ю. (2003). Фракционирование и очистка ферментов, хранящихся в латексе папайи Carica. J Chromatog.B Vol. 790. стр. 229-238.
  18. ^ ab Snider, Mark J.; Wolfenden, Richard (2001-08-30). «Связанная с сайтом вода и недостатки менее совершенного аналога переходного состояния». Биохимия . 40 (38): 11364–11371. doi :10.1021/bi011189+. ISSN  0006-2960. PMID  11560484.
  19. ^ Laidler KJ. Физическая химия с биологическими приложениями. Menlo Park, CA: Benjamin Cummings, 1978; стр. 427–451.
  20. ^ ab Cornell, Hugh J.; Stelmasiak, Teodor (2011). «Caricain: A basis for энзимотерапии целиакии». South African Journal of Science . 107 (9/10). doi : 10.4102/sajs.v107i9/10.529 .
  21. ^ Корнелл, Х.Дж.; Доэрти, В.; Стелмасиак, Т. (21.01.2009). «Ферменты латекса папайи, способные к детоксикации глиадина». Аминокислоты . 38 (1): 155–165. doi :10.1007/s00726-008-0223-6. ISSN  0939-4451.

Внешние ссылки