Клеточно-проникающие пептиды ( CPP ) — это короткие пептиды , которые облегчают клеточный прием и усвоение молекул, начиная от наночастиц и заканчивая небольшими химическими соединениями и крупными фрагментами ДНК . «Груз» связан с пептидами либо посредством химической связи через ковалентные связи , либо через нековалентные взаимодействия . [1]
CPP доставляют груз в клетки, обычно через эндоцитоз , для использования в исследованиях и медицине. Текущее использование ограничено отсутствием клеточной специфичности в доставке груза с помощью CPP и недостаточным пониманием способов их поглощения. Другие механизмы доставки, которые были разработаны, включают CellSqueeze и электропорацию . [ необходима цитата ]
CPP обычно имеют аминокислотный состав, который либо содержит высокое относительное обилие положительно заряженных аминокислот, таких как лизин или аргинин, либо имеет последовательности, которые содержат чередующийся рисунок полярных , заряженных аминокислот и неполярных , гидрофобных аминокислот. [2] Эти два типа структур называются поликатионными или амфипатическими , соответственно. Третий класс CPP — это гидрофобные пептиды, содержащие только неполярные остатки с низким чистым зарядом или гидрофобные аминокислотные группы, которые имеют решающее значение для клеточного поглощения. [3] [4]
Трансактивирующий активатор транскрипции (ТАТ) из вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1) был первым обнаруженным CPP. В 1988 году две лаборатории независимо друг от друга обнаружили, что ТАТ может эффективно поглощаться из окружающей среды многочисленными типами клеток в культуре . [5] С тех пор число известных CPP значительно возросло, и были созданы низкомолекулярные синтетические аналоги с более эффективными свойствами белковой трансдукции . [6]
Недавнее открытие показало, что Papillomaviridae , такие как вирус папилломы человека , используют CPP для проникновения через внутриклеточную мембрану , чтобы инициировать ретроградный перенос вирусной единицы в ядро. [7]
Проникающие в клетки пептиды имеют разные размеры, аминокислотные последовательности и заряды, но все CPP обладают способностью перемещаться через плазматическую мембрану и облегчать доставку различных молекулярных грузов в цитоплазму или органеллу . [1] Никакого реального консенсуса не объясняет механизм перемещения, но кандидатов можно разделить на три механизма: прямое проникновение в мембрану, вход, опосредованный эндоцитозом, и перемещение через транзитную структуру. Трансдукция CPP является областью текущих исследований. [8] [9]
Клеточно-проникающие пептиды (CPP) способны транспортировать различные типы грузовых молекул через плазматическую мембрану; таким образом, они действуют как молекулярные средства доставки. Они имеют многочисленные применения в медицине в качестве агентов доставки лекарств при лечении различных заболеваний, включая рак и ингибиторы вирусов, а также контрастные агенты для маркировки клеток. Примерами последнего являются действие в качестве носителя для GFP , контрастных агентов МРТ или квантовых точек . [10]
Большинство ранних исследований предполагали, что транслокация поликатионных CPP через биологические мембраны происходит посредством энергонезависимого клеточного процесса. Считалось, что транслокация может происходить при 4 °C и, скорее всего, включает прямое электростатическое взаимодействие с отрицательно заряженными фосфолипидами . Исследователи предложили несколько моделей в попытках выяснить биофизический механизм этого энергонезависимого процесса. Хотя CPP способствуют прямому воздействию на биофизические свойства чистых мембранных систем, идентификация артефактов фиксации при использовании флуоресцентно меченых зондов CPP вызвала переоценку механизмов импорта CPP. [11] Эти исследования продвигали эндоцитоз как путь транслокации. Пример прямого проникновения был предложен для TAT. Первым шагом в этой предлагаемой модели является взаимодействие с развернутым белком слияния (TAT) и мембраной через электростатические взаимодействия, которые разрушают мембрану достаточно, чтобы позволить белку слияния пересечь мембрану. После интернализации белок слияния рефолдируется из-за системы шаперонов. Этот механизм не был согласован, и были предложены другие механизмы, включающие клатрин-зависимый эндоцитоз. [12] [13]
Было предложено много более подробных методов поглощения CPP, включая транзитное образование пор. [14] [15] [16] [17] [18] Этот механизм включает в себя сильные взаимодействия между проникающими в клетку пептидами и фосфатными группами по обе стороны липидного бислоя, вставку положительно заряженных боковых цепей аргинина, которые зарождают образование транзитной поры, с последующей транслокацией проникающих в клетку пептидов путем диффузии на поверхности поры. Этот механизм объясняет, как ключевые ингредиенты, такие как взаимодействие между пептидами, большой положительный заряд и, в частности, группы гуанидиния, способствуют поглощению. Предложенный механизм также иллюстрирует важность мембранных колебаний. Действительно, механизмы, которые включают в себя большие колебания структуры мембраны, такие как транзитные поры и вставку заряженных боковых цепей аминокислот, могут быть общими и, возможно, центральными для функций многих функций мембранных белков.
Эндоцитоз — второй механизм, ответственный за клеточную интернализацию. Эндоцитоз — это процесс клеточного поглощения , при котором плазматическая мембрана сворачивается внутрь, чтобы принести вещества в клетку. Во время этого процесса клетки поглощают материал извне клетки, впитывая его своей клеточной мембраной. Классификация клеточной локализации с использованием флуоресценции или ингибиторов эндоцитоза является основой большинства исследований. Однако процедура, используемая во время подготовки этих образцов, создает сомнительную информацию относительно эндоцитоза. Более того, исследования показывают, что проникновение пенетратина в клетку путем эндоцитоза является энергозависимым процессом. Этот процесс инициируется полиаргининами, взаимодействующими с гепарансульфатами , которые способствуют эндоцитозу. Исследования показали, что ТАТ интернализуется посредством формы эндоцитоза, называемой макропиноцитозом. [19] [20]
Исследования показали, что эндоцитоз участвует в интернализации CPP, но было высказано предположение, что в то же время могут проявляться различные механизмы. Это установлено поведением, описанным для пенетратина и транспортана, где и транслокация мембраны, и эндоцитоз происходят одновременно. [21] [22]
Третий механизм, ответственный за транслокацию, основан на образовании инвертированных мицелл . Инвертированные мицеллы представляют собой агрегаты коллоидных поверхностно-активных веществ, в которых полярные группы сосредоточены внутри, а липофильные группы распространяются наружу в растворитель. Согласно этой модели, димер пенетратина объединяется с отрицательно заряженными фосфолипидами, тем самым образуя инвертированную мицеллу внутри липидного бислоя. Структура инвертированных мицелл позволяет пептиду оставаться в гидрофильной среде. [23] [24] [25] Тем не менее, этот механизм все еще является предметом обсуждения, поскольку распределение пенетратина между внутренней и внешней мембраной несимметрично. Это несимметричное распределение создает электрическое поле, которое было хорошо установлено. Увеличение количества пептида на внешних листках приводит к тому, что электрическое поле достигает критического значения, которое может генерировать событие, подобное электропорации.
Последний механизм подразумевает, что интернализация происходит пептидами, которые принадлежат к семейству первичных амфипатических пептидов, MPG и Pep-1. Были предложены две похожие модели на основе физико-химических исследований, состоящих из кругового дихроизма, инфракрасной Фурье-спектроскопии и ядерной магнитно-резонансной спектроскопии. Эти модели связаны с электрофизиологическими измерениями и исследованиями, которые способны имитировать модельные мембраны, такие как монослой на границе раздела воздух-вода. Структура, дающая начало порам, является основным отличием между предложенной моделью MPG и Pep-1. В модели MPG пора образована структурой b-бочки, тогда как Pep-1 связан со спиралями. Кроме того, в обеих моделях были обнаружены сильные гидрофобные взаимодействия фосфолипида и пептида. [26] [27] В двух пептидных моделях сложенные части молекулы-носителя коррелируют с гидрофобным доменом, хотя остальная часть молекулы остается неструктурированной. [28]
Транслокация, облегчаемая проникающим в клетку пептидом, является предметом больших споров. Были представлены доказательства того, что транслокация может использовать несколько различных путей для захвата. Кроме того, механизм транслокации может зависеть от того, является ли пептид свободным или прикрепленным к грузу. Количественное поглощение свободного или связанного с грузом CPP может сильно различаться, но исследования не доказали, является ли это изменение результатом эффективности транслокации или разницы в пути транслокации. Вероятно, что результаты указывают на то, что несколько механизмов CPP конкурируют и что несколько путей способствуют интернализации CPP. [29]
Макромолекулы на основе нуклеиновых кислот, такие как siRNA, антисмысловые олигонуклеотиды, ложные ДНК и плазмиды, являются перспективными биологическими и фармакологическими терапевтическими средствами для регуляции экспрессии генов. [30] [31] [32] Однако, в отличие от других низкомолекулярных препаратов, их разработка и применение ограничены высокой молекулярной массой и отрицательными зарядами, что приводит к низкой эффективности поглощения и низкому клеточному трафику. Для преодоления этих проблем было разработано несколько различных систем доставки, включая конъюгат CPP-нуклеиновой кислоты, который является мощным инструментом.
Большинство комплексов CPP-нуклеиновая кислота, которые были предложены до сих пор, образованы посредством ковалентной связи. Ряд комплексов CPP-нуклеиновая кислота были синтезированы с помощью различных химических реакций, которые являются либо стабильными, либо расщепляемыми связями. И наиболее широко используемый в публикации метод - это расщепляемые дисульфидные связи посредством полного пошагового твердофазного синтеза или соединения фрагментов в растворе или твердой фазе. [33] Также были разработаны некоторые другие стратегии, такие как стабильные амидные, тиазолидиновые, оксимные и гидразиновые связи. [34] Однако эти методы ковалентного связывания ограничены опасением, что синтетическая ковалентная связь между CPP и нуклеиновой кислотой может изменить биологическую активность последней. [35] Таким образом, новая нековалентная стратегия, не требующая химической модификации с короткими амфипатическими CPP, такими как MPG и Pep-1 в качестве носителей, была успешно применена для доставки грузов. [36] [37] Эти нековалентные конъюгаты образуются либо посредством электростатических, либо гидрофобных взаимодействий. С помощью этого метода грузы, такие как нуклеиновые кислоты и белки, могут эффективно доставляться, сохраняя при этом полную биологическую активность.
Короткая интерферирующая РНК (siRNA) — это мощный новый инструмент, который может вмешиваться в экспрессию гена определенного заболевания и подавлять ее. [38] Для улучшения клеточного поглощения siRNA были применены стратегии CPP для облегчения доставки siRNA в клетки посредством ковалентных или нековалентных связей. В одном исследовании siRNA ковалентно связана с транспортеном и пенетратином посредством дисульфидной связи на 5'-конце смысловых цепей siRNA для нацеливания на репортеров мРНК люциферазы или eGFP. [39] В другом исследовании конъюгат TAT-siRNA через стабильную тиомалеимидную связь на 3'-конце siRNA был доставлен в клетки HeLa для подавления гена eGFP. [40]
Однако нековалентные стратегии, по-видимому, лучше подходят для доставки siRNA с более значительным биологическим ответом. В одном исследовании комплексы MPG/siRNA, сформированные с помощью стабильной нековалентной стратегии, показали успешное введение siRNA в культивируемые клетки и индуцировали надежную регуляцию целевой мРНК. [37] Кроме того, комплексы MPG/siRNA также применялись для доставки siRNA in vivo в бластоциты мышей для регуляции генов. [41] MPG образует стабильные комплексы с siRNA с низкой скоростью деградации и может быть легко функционализирован для специфического нацеливания, что является основными преимуществами по сравнению с ковалентной технологией CPP.
Доставка клеток siRNA представляет собой ценный инструмент для лечения онкологических заболеваний, вирусных инфекций и генетических расстройств. Однако классические стратегии включают ковалентное связывание молекул-грузов и CPP, что не обеспечивает эффективной защиты молекул siRNA in vivo ; таким образом, результаты, представленные в литературе, не являются согласованными. Недавно были успешно представлены нековалентные стратегии. Вторичные амфипатические пептиды на основе ароматических остатков триптофана и аргинина, связанных с лизином в качестве спейсера, были представлены под названием CADY. CADY содержит короткую пептидную последовательность из 20 аминокислот с последовательностью «Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-цистеамид». [42] Этот пептид способен самоорганизовываться в спиральную форму с гидрофильными и гидрофобными остатками на разных сторонах молекулы, он имеет две различные ориентации поверхности, которые представляют самую низкую энергию, и он способен образовывать комплексы с siRNA в различных молярных соотношениях, варьирующихся от 1:1 до 80:1. CADY способен образовывать щит вокруг молекулы siRNA, защищая ее от биодеградационных процессов, которые могут происходить до того, как произойдет проникновение в клетку. Эти типы субстратов могут иметь важное применение in vivo .
Антисмысловые олигонуклеотиды (asON) использовались в фундаментальных исследованиях и разрабатываются в качестве возможных медицинских методов лечения. Были разработаны стратегии CPP для доставки антисмысловых олигомеров, таких как PNA и PMO, в клетки. Преодолевая отталкивание клеточной мембраной отрицательно заряженных ON и деградацию asON ферментами, CPP повышают биодоступность asON. Два типа нейтральных аналогов ON, пептидная нуклеиновая кислота ( PNA ) и фосфородиамидатные морфолино олигомеры (PMO или Morpholino ) становятся доминирующими в этой области. PNA была конъюгирована с различными CPP либо через дисульфидные связи, либо через стабильные амидные связи. [43] Например, антисмысловая активность внутри клеток, которая блокировала экспрессию рецептора галанина, наблюдалась, когда 21-мерная PNA была связана с пенетратином. [44] Результаты по противовирусной активности PNA, нацеленной на ВИЧ-1, также были зарегистрированы посредством дисульфидной связи с TAT. [45] Конъюгаты CPP-PMO также успешно использовались для ингибирования репликации нескольких вирусов, таких как SARS [46] и гриппа [47] , а присоединение CPP повысило эффективность модифицирующих сплайсинг морфолино в разработке для лечения мышечной дистрофии Дюшенна [48]
Decoy DNA — это экзогенная двухцепочечная ДНК (dsDNA), которая может имитировать последовательность промотора, которая может ингибировать активность определенного фактора транскрипции. [49] Но dsDNA имеет ту же проблему, что и другие терапевтические средства, плохую биодоступность. В одном исследовании CPP TP и TP10 были связаны с ложной ДНК NFкB, что блокировало эффект активации NFкB, вызванной интерлейкином-1, и экспрессию гена IL-6. [50] В другом исследовании связанная с TP10 ложная ДНК Myc снизила пролиферативную способность клеток N2a. [51]
Отдельные гены могут быть вставлены в определенные сайты на плазмидах, а рекомбинантные плазмиды могут быть введены в живые клетки. Метод с использованием макроразветвленного TAT был предложен для доставки плазмидной ДНК в различные клеточные линии и показал значительные возможности трансфекции. [52] Было обнаружено, что мультимеры TAT увеличивают эффективность трансфекции плазмидной ДНК в 6-8 раз больше, чем поли-L-аргинин или мутантный TAT2-M1, и в 390 раз по сравнению со стандартными векторами. [53]
Разработка терапевтических белков, которые представляют собой ценный метод лечения заболеваний, ограничена низкой эффективностью традиционных методов доставки. Было обнаружено, что оценка цитозольной доставки белков, связанных с CPP, подвержена артефактам [54] и поэтому требует использования методов оценки, которые отличают истинную цитозольную доставку от прикрепленных к поверхности клеток или эндосомально захваченных CPP-белков. [55] [56] Недавно было сообщено о нескольких методах, использующих CPP в качестве средств доставки биологически активных полноразмерных белков в живые клетки и животных.
Несколько групп успешно доставили слитые с CPP белки in vitro . TAT смог доставить различные белки, такие как пероксидаза хрена и РНКаза А через клеточную мембрану в цитоплазму в различных клеточных линиях in vitro . Диапазон размеров белков с эффективной доставкой составляет от 30 кДа до 120-150 кДа. В одном исследовании слитые с TAT белки быстро интернализуются посредством макропиноцитоза, зависящего от липидного плота, с использованием трансдуктивного репортерного анализа рекомбиназы TAT-Cre на живых клетках. [57] В другом исследовании слитый с TAT белок был доставлен в митохондрии клеток рака молочной железы и снизил выживаемость клеток рака молочной железы, что показало способность слитых с TAT белков модулировать митохондриальную функцию и выживаемость клеток. Более того, cR10, циклический полиаргининовый CPP, обеспечил независимую от эндоцитозы трансдукцию антигенсвязывающих белков через клеточную мембрану с немедленной биодоступностью. Таким образом, авторы исследования смогли доставить флуоресцентные антигенсвязывающие белки в клетки, что облегчило иммуноокрашивание живых клеток. [58] Однако лишь немногие исследования in vivo увенчались успехом. В одном исследовании доставка in vivo сшитых TAT или пенетратином Fab-фрагментов привела к различным распределениям органов и общему увеличению задержки органов, что показало локализацию тканей. [59]
Нековалентный метод, который формирует комплексы CPP/белок, также был разработан для устранения ограничений ковалентных методов, таких как химическая модификация перед сшиванием и денатурация белков перед доставкой. В одном исследовании короткий амфипатический пептидный носитель, Pep-1, и белковые комплексы оказались эффективными для доставки. Было показано, что Pep-1 может способствовать быстрому клеточному поглощению различных пептидов, белков и даже полноразмерных антител с высокой эффективностью и меньшей токсичностью. Этот подход значительно упростил формулировку реагентов. [60]
CPP нашли применение в качестве переносчиков контрастных веществ через плазматические мембраны. Эти контрастные вещества способны маркировать опухолевые клетки, что делает эти соединения важными инструментами в диагностике рака; они также используются в клеточных экспериментах in vivo и in vitro . Наиболее важные классы CPP выделены из вирусов, такие как TAT (трансактивированная транскрипция), полученные из ВИЧ-1, пенетратин и транспортан. Наиболее широко используемые CPP основаны на производных TAT. TAT — это богатый аргинином CPP. Несколько улучшений для этого субстрата включают использование неприродных β или γ аминокислот. Эта стратегия предлагает множество преимуществ, таких как устойчивость к протеолитической деградации, естественный процесс деградации, при котором пептидные связи гидролизуются до аминокислот. Вставка неприродной кислоты в пептидную цепь имеет множество преимуществ. Она способствует образованию стабильных фолдамеров с отчетливой вторичной структурой. [61] [62] [63] β-пептиды конформационно более стабильны в водном растворе, чем встречающиеся в природе пептиды, особенно для небольших цепей. Вторичная структура усиливается присутствием жесткой β-аминокислоты, которая содержит фрагменты циклогексана или циклопентана. Эти фрагменты создают более жесткую структуру и влияют на угол раскрытия фолдамера. Эти особенности важны для нового дизайна пептидов. Спиральные β-пептиды имитируют антимикробную активность пептидов защиты хозяина. [64] [65] [66] Эта особенность требует ориентации катионных – гидрофильных с одной стороны и гидрофобных остатков с другой стороны спирали. Присоединение флуоресцентной группы к одной головке молекулы придает контрастные свойства. Новая стратегия повышения способности CPP поглощать клетки основана на ассоциации поликатионных и полианионных доменов, которые разделены линкером. Клеточная ассоциация поликатионных остатков (полиаргинина) с отрицательно заряженными мембранными клетками эффективно блокируется присутствием полианионного остатка (полиглутаминовой кислоты) и линкера, которые обеспечивают надлежащее расстояние между этими двумя заряженными остатками для максимизации их взаимодействия. Эти пептиды принимают шпильковую структуру, подтвержденную корреляцией эффекта Оверхаузера для протон-протонной близости двух заряженных фрагментов. На этом этапе только линкер подвергается гидролизу протеазой in vivo . Происходит гидролиз линкера, и два заряженных фрагмента испытывают большую конформационную свободу. В отсутствие линкера катионный пептид может более эффективно взаимодействовать с целевой клеткой, и поглощение клеткой происходит до протеолиза. Эта стратегия нашла применение в маркировке опухолевых клеток in vivo. Опухолевые клетки были помечены за считанные минуты. Деградацию линкера можно предсказать по количеству D-аминокислот (неестественный изомер), включенных в пептидную цепь, это ограничивает протеолиз in vivo центральным линкером. [67] [68] [69] [70]
Квантовые точки (КТ) представляют собой относительно новый класс флуоресцентных зондов, которые обладают превосходными оптическими свойствами, чем классические органические красители на основе флуоресцентных групп. Главные преимущества КТ включают высокие квантовые выходы, широкие спектры поглощения, спектры эмиссии с регулируемым размером и хорошую устойчивость к химической и фотохимической деградации. Тесты in vivo показали, что несколько положительно заряженных пептидов (на основе остатков гуанидина) способны пересекать клеточные мембраны и способствовать клеточному поглощению прикрепленных молекул, включая квантовые точки. Свойства КТ можно легко модифицировать, изменяя связанные с ними органические субстраты, что предлагает универсальный биологический инструмент в качестве клеточных маркеров. Ведутся исследования по оптимизации методологий внутриклеточной доставки КТ и биоконъюгатов КТ и характеристике долгосрочных фотофизических свойств in vivo. [71] [72] [73] [74] [75]
Квантовые точки представляют собой коллоидные нанокристаллы на основе кадмиево-селенового (CdSe) ядра, покрытого слоем цинка-серы (ZnS). Этот субстрат интенсивно использовался в качестве клеточного маркера, поскольку CdSe излучает в видимой области и является отличным контрастным агентом, в то время как слой ZnS защищает ядро от окисления, а также от выщелачивания CdSe в окружающий раствор. Эта стратегия также улучшает выход фотолюминесценции. Свойства можно настраивать толщиной защитных слоев ZnS. Коллоидное излучение КТ можно модулировать от УФ-видимого до инфракрасного диапазона с помощью различных типов покрывающих агентов, таких как ZnS, CdS, ZnSe, CdTe и PbSe. Свойства квантовых точек также можно настраивать с помощью синтетической схемы, высокотемпературных смесей растворителя/лиганда, которые влияют на свойства нанокристаллов. Высококачественные контрастные агенты КТ получают при повышенных температурах; Однако, поскольку они имеют более низкую растворимость в воде, их использование в качестве клеточных маркеров ограничено. Требуется дальнейшая функционализация с гидрофильными лигандами. [76] [73]
Преимущества КТ представлены их быстрым действием; они способны маркировать целевую ткань или клетку за считанные секунды. Исследования in vivo показывают, что КТ способны селективно маркировать раковые клетки, и они накапливаются в опухолевых участках. Опухолевые клетки, маркированные КТ, можно отслеживать с помощью многофотонной микроскопии, поскольку они проникают в легочную ткань. В обоих исследованиях спектральная визуализация и автофлуоресцентное вычитание позволили провести многоцветную визуализацию клеток и тканей in vivo. Основным недостатком КТ является их относительно высокая токсичность. Функционализации с различными субстратами, которые увеличивают биоаффинность и уменьшают токсичность, находятся в процессе разработки. Например, сера из оболочки КТ способна образовывать обратимые дисульфидные связи с широким классом органических соединений. [77]
Магнитно-резонансная томография (МРТ) является мощным инструментом для диагностики заболеваний, таких как метастазы рака и воспаление, с использованием различных хелатов металлов . Хелаты металлов увеличивают контрастный сигнал между нормальными и больными тканями, катализируя релаксацию протонов воды в их непосредственной близости. Типичными примерами являются низкомолекулярные хелаты Gd3+ и суперпарамагнитный оксид железа (SPIO). Введение этих агентов in vivo позволяет маркировать опухолевые клетки; или клетки могут быть маркированы in vitro контрастными агентами, а затем их можно вводить и контролировать in vivo с помощью методов МРТ. [78] [79] [80]
Наночастицы SPIO обеспечивают высокую чувствительность в МРТ, но они имеют более низкое сродство к клеткам; они работают при высоких концентрациях. Функционализации этих соединений с использованием дендримерных гуанидинов показали схожую активность с CPP на основе TAT, но более высокую токсичность. Новые субстраты на основе дендронов с гидроксильными или аминными перифериями показывают низкую токсичность. Применение SPIO включает маркировку клеток in vivo ; из-за низкой токсичности они клинически одобрены для использования в визуализации печени , селезенки и желудочно-кишечного тракта. [81]
Наличие остатков октамера аргинина позволяет клеточной мембранной трансдукции различных молекул-грузов, включая пептиды, ДНК, siRNA и контрастные агенты. Однако способность к пересечению мембраны не является однонаправленной; CPP на основе аргинина способны входить и выходить из клеточной мембраны, демонстрируя общее снижение концентрации контрастного агента и снижение сигнала магнитного резонанса (МР) со временем. Это ограничивает их применение in vivo . Для решения этой проблемы контрастные агенты с дисульфидной, обратимой связью между хелатом металла и трансдукционным фрагментом усиливают связанное с клеткой удержание. Дисульфидная связь восстанавливается средой целевой клетки, и хелат металла остается захваченным в цитоплазме, увеличивая время удержания хелата в целевой клетке. [82] [83] [84] [85]
{{cite book}}
: CS1 maint: DOI неактивен по состоянию на ноябрь 2024 г. ( ссылка ){{cite book}}
: CS1 maint: DOI неактивен по состоянию на ноябрь 2024 г. ( ссылка )