Люцифераза – общий термин для класса окислительных ферментов , вызывающих биолюминесценцию , и обычно отличается от фотопротеина . Это название впервые использовал Рафаэль Дюбуа , который изобрел слова люциферин и люцифераза для обозначения субстрата и фермента соответственно. [1] Оба слова происходят от латинского слова lucifer , означающего «носитель света», которое, в свою очередь, происходит от латинских слов «свет» ( lux) и «приносить или нести» ( ferre) . [2]
Люциферазы широко используются в биотехнологии , для биолюминесцентной визуализации [3] микроскопии и в качестве репортерных генов для многих из тех же применений, что и флуоресцентные белки . Однако, в отличие от флуоресцентных белков, люциферазы не требуют внешнего источника света , но требуют добавления люциферина , потребляемого субстрата.
Различные организмы регулируют производство света с помощью различных люцифераз в различных реакциях светоизлучения. Большинство изученных люцифераз были обнаружены у животных, включая светлячков [4] и многих морских животных, таких как копеподы , медузы и морские анютины глазки . Тем не менее, люциферазы были изучены в светящихся грибах, таких как гриб Джек-О-Фонарь , а также в других царствах, включая биолюминесцентные бактерии и динофлагелляты .
Люциферазы светлячков , которых насчитывается более 2000 видов , и других Elateroidea (жуков-щелкунов и их родственников в целом) достаточно разнообразны, чтобы их можно было использовать в молекулярной филогении . [5] У светлячков необходимый кислород подается через трубку в брюшной полости, называемую брюшной трахеей . Одной из хорошо изученных люцифераз является люцифераза светлячка Photinini Photinuspyralis , оптимум pH которой составляет 7,8. [6]
Также хорошо изучена морская анютины глазки Renilla reniformis . В этом организме люцифераза ( ренилла-люциферин-2-монооксигеназа ) тесно связана с люциферин-связывающим белком, а также с зеленым флуоресцентным белком ( GFP ). Кальций запускает высвобождение люциферина ( целентеразина ) из белка, связывающего люциферин. Затем субстрат становится доступным для окисления люциферазой, где он разлагается до целентерамида с последующим высвобождением энергии. В отсутствие GFP эта энергия выделялась бы в виде фотона синего света (пиковая длина волны излучения 482 нм). Однако из-за тесно связанного GFP энергия, выделяемая люциферазой, вместо этого передается посредством резонансной передачи энергии флуорофору GFP и впоследствии высвобождается в виде фотона зеленого света (пиковая длина волны излучения 510 нм). Катализируемая реакция: [7]
Недавно были идентифицированы новые люциферазы, которые, в отличие от других люцифераз, представляют собой молекулы, секретируемые естественным путем. Одним из таких примеров является целентеразин -зависимая люцифераза Metridia (MetLuc, A0A1L6CBM1 ), полученная из морского копепода Metridia longa . Ген люциферазы, секретируемой Metridia longa, кодирует белок массой 24 кДа, содержащий N-концевой секреторный сигнальный пептид из 17 аминокислотных остатков. Чувствительность и высокая интенсивность сигнала этой молекулы люциферазы оказываются полезными во многих репортерских исследованиях. Одним из преимуществ использования секретируемой репортерной молекулы, такой как MetLuc, является протокол отсутствия лизиса, который позволяет проводить анализы на живых клетках и несколько анализов на одной и той же клетке. [8]
Бактериальная биолюминесценция наблюдается у видов Photobacterium, Vibrio fischeri , Vibrio haweyi и Vibrio harveyi . Световое излучение у некоторых биолюминесцентных бактерий использует «антенну», такую как белок люмазин, для приема энергии из первичного возбужденного состояния люциферазы, в результате чего образуется возбужденный хромофор лулназина , который излучает свет с более короткой длиной волны (более синий), в то время как у других используют желтый флуоресцентный белок (YFP) с флавинмононуклеотидом (FMN) в качестве хромофора и излучают свет, смещенный в красную сторону по сравнению со светом люциферазы. [9]
Люцифераза динофлагеллят представляет собой многодоменный белок эукариот , состоящий из N-концевого домена и трех каталитических доменов , каждому из которых предшествует домен спирального пучка. Решена структура каталитического домена динофлагеллятлюциферазы . [10] Основная часть домена представляет собой 10-нитевой бета-цилиндр , который структурно похож на липокалины и FABP . [10] N-концевой домен консервативен между динофлагеллат-люциферазой и люциферин- связывающими белками (LBP). Было высказано предположение, что эта область может опосредовать взаимодействие между LBP и люциферазой или их ассоциацию с вакуолярной мембраной. [11] Домен спирального пучка имеет трехспиральную структуру пучка , которая содержит четыре важных гистидина , которые, как полагают , играют роль в регуляции pH фермента . [10] В β-цилиндре динофлагеллатлюциферазы при pH 8 имеется большой карман для размещения тетрапиррольного субстрата, но нет отверстия для проникновения субстрата. Следовательно, должно произойти значительное конформационное изменение, чтобы обеспечить доступ и пространство для лиганда в активном сайте, и источником этого изменения являются четыре N-концевых остатка гистидина. [10] Видно, что при pH 8 непротонированные остатки гистидина участвуют в сети водородных связей на границе раздела спиралей в пучке, которые блокируют доступ субстрата к активному центру и нарушают это взаимодействие за счет протонирования (при рН 8). pH 6,3) или замена остатков гистидина аланином вызывает большое молекулярное движение пучка, разделяя спирали на 11 Å и открывая каталитический центр. [10] Логично, что остатки гистидина не могут быть заменены аланином в природе, но эта экспериментальная замена дополнительно подтверждает, что более крупные остатки гистидина блокируют активный центр. Кроме того, три последовательности Gly-Gly, одна в N-концевой спирали и две в мотиве спираль-петля-спираль, могут служить шарнирами, вокруг которых вращаются цепи, чтобы еще больше открыть путь к каталитическому сайту и увеличить активную активность. сайт. [10]
Люцифераза динофлагеллят способна излучать свет благодаря взаимодействию со своим субстратом ( люциферином ) и люциферин-связывающим белком (LBP) в органелле сцинтиллона , обнаруженной у динофлагеллят. [10] Люцифераза действует аналогично люциферину и LBP, излучая свет, но каждый компонент функционирует при разном pH. Люцифераза и ее домены не активны при pH 8, но они чрезвычайно активны при оптимальном pH 6,3, тогда как LBP связывает люциферин при pH 8 и высвобождает его при pH 6,3. [10] Следовательно, люциферин высвобождается для реакции с активной люциферазой только тогда, когда сцинтиллон подкисляется до pH 6,3. Следовательно, чтобы снизить pH, в сцинтиллонной мембране открываются потенциалзависимые каналы , позволяющие проникнуть протонам из вакуоли , обладающей потенциалом действия , возникающим в результате механической стимуляции. [10] Следовательно, можно видеть, что потенциал действия в вакуолярной мембране приводит к подкислению, а это, в свою очередь, позволяет высвободить люциферин для реакции с люциферазой в сцинтиллоне, вызывая вспышку синего света.
Все люциферазы классифицируются как оксидоредуктазы ( EC 1.13.12.-), что означает, что они действуют на одиночных доноров с включением молекулярного кислорода. Поскольку люциферазы происходят из многих различных семейств белков , которые не связаны между собой, не существует объединяющего механизма, поскольку любой механизм зависит от комбинации люциферазы и люциферина. Однако было показано, что все охарактеризованные на сегодняшний день реакции люциферазы-люциферина на определенной стадии требуют молекулярного кислорода .
Реакция, катализируемая бактериальной люциферазой, также является окислительным процессом:
В ходе реакции молекулярный кислород окисляет флавинмононуклеотид и длинноцепочечный алифатический альдегид до алифатической карбоновой кислоты . В результате реакции образуется возбужденный промежуточный гидроксифлавин, который дегидратируется до продукта FMN с испусканием сине-зеленого света. [12]
Почти вся энергия, вложенная в реакцию, преобразуется в свет. Эффективность реакции составляет от 80% [13] до 90% [14] . Для сравнения, лампа накаливания преобразует в свет только около 10% своей энергии [15] , а светодиод мощностью 150 люмен на ватт (лм/Вт) преобразует 20% входной энергии в видимый свет. [14]
Люциферазы можно производить в лаборатории с помощью генной инженерии для ряда целей. Гены люциферазы можно синтезировать и вставлять в организмы или трансфицировать в клетки. По состоянию на 2002 год мыши , тутовые черви и картофель — это лишь некоторые из организмов, которые уже были созданы для производства этого белка. [16]
В люциферазной реакции свет излучается, когда люцифераза действует на соответствующий субстрат люциферина . Эмиссия фотонов может быть обнаружена с помощью светочувствительного прибора, такого как люминометр или оптический микроскоп с ПЗС-камерой . Это позволяет наблюдать биологические процессы. [17] Поскольку для биолюминесценции люциферазы не требуется световое возбуждение, автофлуоресценция минимальна и, следовательно, биолюминесцентный сигнал практически не имеет фона. [18] Таким образом, даже 0,02 пг можно точно измерить с помощью стандартного сцинтилляционного счетчика . [19]
В биологических исследованиях люцифераза обычно используется в качестве репортера для оценки транскрипционной активности в клетках, трансфицированных генетической конструкцией, содержащей ген люциферазы под контролем интересующего промотора . [20] Кроме того, пролюминесцентные молекулы, которые превращаются в люциферин при активности определенного фермента, можно использовать для обнаружения активности фермента в связанных или двухэтапных анализах люциферазы. Такие субстраты , среди прочего, использовались для обнаружения активности каспаз и активности цитохрома P450 . [17] [20]
Люциферазу также можно использовать для определения уровня клеточного АТФ в анализах жизнеспособности клеток или анализах киназной активности. [20] [21] Люцифераза может действовать как сенсорный белок АТФ посредством биотинилирования . Биотинилирование иммобилизует люциферазу на поверхности клетки путем связывания с комплексом стрептавидин - биотин . Это позволяет люциферазе обнаруживать отток АТФ из клетки и эффективно отображать высвобождение АТФ в реальном времени посредством биолюминесценции. [22] Люциферазу можно дополнительно сделать более чувствительной к обнаружению АТФ за счет увеличения интенсивности люминесценции за счет изменения определенных аминокислотных остатков в последовательности белка. [23]
Визуализация всего организма (называемая in vivo, если она неповреждена, или иначе называемая визуализацией ex vivo , например, живой, но эксплантированной ткани) является мощным методом изучения популяций клеток в живых растениях или животных, таких как мыши. [24] Различные типы клеток (например, стволовые клетки костного мозга, Т-клетки) могут быть сконструированы для экспрессии люциферазы, что позволяет их неинвазивную визуализацию внутри живого животного с использованием чувствительной камеры устройства с зарядовой парой ( камера ПЗС ). Этот метод использовался для наблюдения за онкогенезом и реакцией опухолей на лечение на животных моделях. [25] [26] Однако факторы окружающей среды и терапевтические вмешательства могут вызывать некоторые несоответствия между опухолевой нагрузкой и интенсивностью биолюминесценции в отношении изменений пролиферативной активности. Интенсивность сигнала, измеренного с помощью визуализации in vivo, может зависеть от различных факторов, таких как абсорбция D -люциферина через брюшину, кровоток, проницаемость клеточных мембран, наличие кофакторов, внутриклеточный pH и прозрачность вышележащей ткани, а также от количество люциферазы. [27]
Люцифераза — термочувствительный белок, который используется в исследованиях денатурации белков , проверке защитных способностей белков теплового шока . Возможности использования люциферазы продолжают расширяться. [28]
СМИ, связанные с люциферазой, на Викискладе?