stringtranslate.com

Термодинамика нуклеиновых кислот

Термодинамика нуклеиновых кислот — это исследование того, как температура влияет на структуру нуклеиновой кислоты двухцепочечной ДНК (дцДНК). Температура плавления ( T m ) определяется как температура, при которой половина нитей ДНК находится в состоянии случайного клубка или одноцепочечного (оцДНК). Т м зависит от длины молекулы ДНК и ее конкретной нуклеотидной последовательности. ДНК, находящаяся в состоянии, когда две ее цепи диссоциированы (т.е. молекула дцДНК существует в виде двух независимых цепей), называется денатурированной под действием высокой температуры.

Концепции

Гибридизация

Гибридизация — это процесс установления нековалентного , специфичного для последовательности взаимодействия между двумя или более комплементарными цепями нуклеиновых кислот в единый комплекс, который в случае двух цепей называется дуплексом . Олигонуклеотиды , ДНК или РНК в нормальных условиях связываются с комплементарной цепью, поэтому две идеально комплементарные цепи легко связываются друг с другом. Чтобы уменьшить разнообразие и получить наиболее энергетически выгодные комплексы, в лабораторной практике применяется метод, называемый отжигом . Однако из-за различной молекулярной геометрии нуклеотидов одно-единственное несоответствие между двумя цепями сделает связывание между ними менее энергетически выгодным. Измерение влияния несовместимости оснований путем количественного определения температуры, при которой отжигаются две цепи, может предоставить информацию о сходстве последовательности оснований между двумя отжигаемыми цепями. Комплексы можно диссоциировать путем термической денатурации , также называемой плавлением. При отсутствии внешних негативных факторов процессы гибридизации и плавления могут повторяться подряд до бесконечности, что закладывает основу для полимеразной цепной реакции . Чаще всего образуются пары нуклеиновых оснований A=T и G≡C, из которых последнее более стабильно.

Денатурация

Денатурация ДНК , также называемая плавлением ДНК, представляет собой процесс, при котором двухцепочечная дезоксирибонуклеиновая кислота раскручивается и разделяется на одноцепочечные цепи посредством разрушения гидрофобных притяжений между основаниями. См. Гидрофобный эффект . Оба термина используются для обозначения процесса, который происходит при нагревании смеси, хотя «денатурация» может также относиться к разделению нитей ДНК, вызванному такими химическими веществами, как формамид или мочевина . [1]

Процесс денатурации ДНК можно использовать для анализа некоторых аспектов ДНК. Поскольку спаривание оснований цитозина и гуанина обычно сильнее, чем спаривание оснований аденина и тимина, количество цитозина и гуанина в геноме называется его GC-содержанием и может быть оценено путем измерения температуры, при которой геномная ДНК плавится. [2] Более высокие температуры связаны с высоким содержанием GC.

Денатурацию ДНК также можно использовать для обнаружения различий между двумя разными последовательностями ДНК. ДНК нагревается и денатурируется до одноцепочечного состояния, а смесь охлаждается, чтобы позволить нитям регибридизироваться. Гибридные молекулы образуются из схожих последовательностей, и любые различия между этими последовательностями приведут к нарушению спаривания оснований. В геномном масштабе этот метод использовался исследователями для оценки генетического расстояния между двумя видами — процесс, известный как гибридизация ДНК-ДНК . [3] В контексте одной изолированной области ДНК денатурирующие градиентные гели и гели с температурным градиентом могут использоваться для обнаружения наличия небольших несоответствий между двумя последовательностями, процесс, известный как гель-электрофорез в температурном градиенте . [4] [5]

Методы анализа ДНК, основанные на температуре плавления, имеют тот недостаток, что они являются заменителями для изучения лежащей в основе последовательности; Секвенирование ДНК обычно считается более точным методом.

Процесс плавления ДНК также используется в методах молекулярной биологии, особенно в полимеразной цепной реакции . Хотя температура плавления ДНК не является диагностической в ​​этом методе, методы оценки T m важны для определения соответствующих температур для использования в протоколе. Температуру плавления ДНК также можно использовать в качестве показателя для выравнивания силы гибридизации набора молекул, например, олигонуклеотидных зондов микрочипов ДНК .

Отжиг

Отжиг в генетике означает соединение комплементарных последовательностей одноцепочечной ДНК или РНК посредством водородных связей с образованием двухцепочечного полинуклеотида . Прежде чем произойдет отжиг, может потребоваться фосфорилирование одной из цепей с помощью фермента, такого как киназа , чтобы обеспечить возникновение надлежащей водородной связи. Термин «отжиг» часто используется для описания связывания зонда ДНК или связывания праймера с цепью ДНК во время полимеразной цепной реакции . Этот термин также часто используется для описания реформации ( ренатурации ) обратно-комплементарных нитей, которые были разделены под действием тепла (термически денатурированы). Белки, такие как RAD52, могут способствовать отжигу ДНК. Отжиг цепи ДНК — ключевой этап пути гомологичной рекомбинации . В частности, во время мейоза зависимый от синтеза отжиг цепи является основным путем гомологичной рекомбинации.

Укладка

Штабелирование – это стабилизирующее взаимодействие между плоскими поверхностями соседних оснований. Укладка может происходить с любой гранью основания, то есть 5 футов-5 футов, 3 футов-3 дюйма и наоборот. [7]

Укладке в «свободных» молекулах нуклеиновой кислоты в основном способствуют межмолекулярные силы , в частности, электростатическое притяжение между ароматическими кольцами, процесс, также известный как пи-стэкинг . Для биологических систем с водой в качестве растворителя гидрофобный эффект способствует образованию спирали. [8] Укладка является основным стабилизирующим фактором двойной спирали ДНК. [9]

Вклад стэкинга в свободную энергию молекулы можно оценить экспериментально, наблюдая равновесие изогнутой стопки в разорванной ДНК . Такая стабилизация зависит от последовательности. [6] Степень стабилизации зависит от концентрации соли и температуры. [9]

Термодинамика модели двух состояний

Для расчета значений T m используется несколько формул . [10] [11] Некоторые формулы более точны в предсказании температуры плавления дуплексов ДНК. [12] Для ДНК-олигонуклеотидов, то есть коротких последовательностей ДНК, термодинамику гибридизации можно точно описать как процесс с двумя состояниями. В этом приближении пренебрегают возможностью промежуточных состояний частичного связывания при образовании двухцепочечного состояния из двух одноцепочечных олигонуклеотидов. При таком предположении можно элегантно описать термодинамические параметры образования двухцепочечной нуклеиновой кислоты АВ из одноцепочечных нуклеиновых кислот А и В.

АВ ↔ А + Б

Константа равновесия этой реакции равна . Согласно уравнению Вант-Гоффа, связь между свободной энергией Δ G и K равна Δ G° = - RT ln K , где R – константа закона идеального газа, а T – температура реакции в Кельвинах. Это дает для системы нуклеиновых кислот:

.

Температура плавления T m возникает, когда половина двухцепочечной нуклеиновой кислоты диссоциирует. Если дополнительных нуклеиновых кислот нет, то [A], [B] и [AB] будут равны и равны половине начальной концентрации двухцепочечной нуклеиновой кислоты, [AB] исходной . Это дает выражение для температуры плавления дуплекса нуклеиновой кислоты

.

Поскольку Δ G ° = Δ H ° - T Δ S °, T m также определяется выражением

.

Термины ΔH ° и ΔS ° обычно обозначают ассоциацию, а не реакцию диссоциации (см., например, метод ближайшего соседа). Тогда эта формула превращается в: [13]

, где [B] всего ≤ [A] всего .

Как уже упоминалось, это уравнение основано на предположении, что в плавлении участвуют только два состояния: двухцепочечное состояние и состояние случайной катушки. Однако нуклеиновые кислоты могут плавиться через несколько промежуточных состояний. Для объяснения такого сложного поведения необходимо использовать методы статистической механики , что особенно актуально для длинных последовательностей.

Оценка термодинамических свойств по последовательности нуклеиновой кислоты

В предыдущем пункте показано, как связаны между собой температура плавления и термодинамические параметры ( ΔG ° или ΔH ° & ΔS ° ). Из наблюдения за температурой плавления можно экспериментально определить термодинамические параметры. И наоборот, что важно для приложений, когда известны термодинамические параметры данной последовательности нуклеиновой кислоты, можно предсказать температуру плавления. Оказывается, для олигонуклеотидов эти параметры хорошо аппроксимируются моделью ближайшего соседа.

Метод ближайшего соседа

Взаимодействие оснований разных цепей в некоторой степени зависит от соседних оснований. Вместо того, чтобы рассматривать спираль ДНК как цепочку взаимодействий между парами оснований , модель ближайшего соседа рассматривает спираль ДНК как цепочку взаимодействий между «соседними» парами оснований. [13] Так, например, показанная ниже ДНК имеет взаимодействия ближайших соседей, обозначенные стрелками.

    ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
5' C-G-T-T-G-A 3'
3' G-C-A-A-C-T 5'

Свободная энергия образования этой ДНК из отдельных нитей ΔG ° представлена ​​(при 37°С) как

Δ G ° 37 (прогнозируемый) = Δ G ° 37 (инициация C/G) + Δ G ° 37 (CG/GC) + Δ G ° 37 (GT/CA) + Δ G ° 37 (TT/AA) + Δ G ° 37 (TG/AC) + Δ G ° 37 (GA/CT) + Δ G ° 37 (инициирование А/Т)

За исключением члена инициации C/G, первый член представляет собой свободную энергию первой пары оснований CG в отсутствие ближайшего соседа. Второй член включает в себя как свободную энергию образования второй пары оснований, GC, так и стэкинг-взаимодействие между этой парой оснований и предыдущей парой оснований. Остальные термины определяются аналогично. В общем, свободная энергия образования дуплекса нуклеиновой кислоты равна

,

где представляет собой свободную энергию, связанную с одной из десяти возможных пар нуклеотидов ближайших соседей, и представляет ее количество в последовательности.

Каждый член Δ G ° имеет энтальпийный Δ H ° и энтропийный Δ S ° параметры, поэтому изменение свободной энергии также определяется выражением

.

Значения ΔH ° и ΔS ° определены для десяти возможных пар взаимодействий. Они приведены в таблице 1 вместе со значением ΔG°, рассчитанным при 37°C. Используя эти значения, значение Δ G 37 ° для дуплекса ДНК, показанного выше, рассчитано как -22,4 кДж/моль. Экспериментальное значение составляет -21,8 кДж/моль.

Параметры, связанные с десятью группами соседей, показанными в таблице 1, определяются по температурам плавления коротких олигонуклеотидных дуплексов. Получается, что только восемь из десяти групп являются независимыми.

Модель ближайшего соседа может быть расширена за пределы пар Уотсона-Крика и включать параметры взаимодействия между несовпадениями и соседними парами оснований. [14] Это позволяет оценивать термодинамические параметры последовательностей, содержащих изолированные несовпадения, например (стрелки указывают несовпадения)

          ↓↓↓
5' G-G-A-C-T-G-A-C-G 3'
3' C-C-T-G-G-C-T-G-C 5'

Эти параметры были установлены на основе экспериментов по плавлению, а расширение Таблицы 1, включающее несоответствия, можно найти в литературе.

Более реалистичный способ моделирования поведения нуклеиновых кислот, по-видимому, состоит в том, чтобы иметь параметры, которые зависят от соседних групп по обе стороны нуклеотида, создавая таблицу с записями типа «TCG/AGC». Однако для спаривания Уотсона-Крика потребуется около 32 групп и даже больше для последовательностей, содержащих несовпадения; количество экспериментов по плавлению ДНК, необходимое для получения надежных данных для такого большого количества групп, было бы неудобно большим. Однако существуют и другие способы доступа к термодинамическим параметрам нуклеиновых кислот: технология микрочипов позволяет параллельно контролировать гибридизацию десятков тысяч последовательностей. Эти данные в сочетании с теорией молекулярной адсорбции позволяют определять многие термодинамические параметры в одном эксперименте [15] и выйти за рамки модели ближайшего соседа. [16] В целом предсказания метода ближайшего соседа достаточно хорошо согласуются с экспериментальными результатами, но некоторые неожиданные последовательности, требующие дальнейшего понимания, все же существуют. [16] Наконец, мы должны также упомянуть повышенную точность, обеспечиваемую анализами разархивирования одиночных молекул, которые открывают множество новых возможностей для понимания термодинамики гибридизации ДНК, а также достоверности модели ближайшего соседа. [17]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Диван, Ройдс (2013). Инструменты и методы биомолекулярной науки . Издательство Оксфордского университета. п. 243.
  2. ^ М. Мандель; Дж. Мармур (1968). Использование профиля ультрафиолетового поглощения и температуры для определения содержания гуанина и цитозина в ДНК. Методы энзимологии. Том. 12. С. 198–206. дои : 10.1016/0076-6879(67)12133-2. ISBN 978-0-12-181856-2.
  3. ^ К.Г. Сибли; Дж. Э. Алквист (1984). «Филогения человекообразных приматов, подтвержденная гибридизацией ДНК-ДНК». Журнал молекулярной эволюции . 20 (1): 2–15. Бибкод : 1984JMolE..20....2S. дои : 10.1007/BF02101980. PMID  6429338. S2CID  6658046.
  4. ^ Р. М. Майерс; Т. Маниатис; Л. С. Лерман (1987). Обнаружение и локализация одноосновных изменений с помощью денатурирующего градиентного гель-электрофореза. Методы энзимологии. Том. 155. стр. 501–527. дои : 10.1016/0076-6879(87)55033-9. ISBN 978-0-12-182056-5. ПМИД  3431470.
  5. ^ Т. По; Г. Стегер; В. Розенбаум; Дж. Капер; Д. Риснер (1987). «Двухцепочечная РНК 5, связанная с кукумовирусом: экспериментальный анализ некрогенных и ненекрогенных вариантов с помощью гель-электрофореза в температурном градиенте». Исследования нуклеиновых кислот . 15 (13): 5069–5083. дои : 10.1093/нар/15.13.5069. ПМК 305948 . ПМИД  3601667. 
  6. ^ ab Протозанова Е, Яковчук П, Франк-Каменецкий МД (2004). «Равновесие сложенного и несложенного на участке Ника ДНК». Дж Мол Биол . 342 (3): 775–785. дои : 10.1016/j.jmb.2004.07.075. ПМИД  15342236.
  7. ^ «Определение терминов». База данных нуклеиновых кислот . Проверено 4 апреля 2019 г.
  8. ^ Спонер, Дж; Спонер, Дж. Э.; Младек, А; Юречка, П; Банаш, П; Отепка М (декабрь 2013 г.). «Природа и величина укладки ароматических оснований в ДНК и РНК: квантовая химия, молекулярная механика и эксперимент». Биополимеры . 99 (12): 978–88. дои : 10.1002/bip.22322. ПМИД  23784745.
  9. ^ аб Яковчук, П; Протозанова Е; Франк-Каменецкий, доктор медицинских наук (2006). «Вклад укладки оснований и спаривания оснований в термическую стабильность двойной спирали ДНК». Исследования нуклеиновых кислот . 34 (2): 564–74. дои : 10.1093/nar/gkj454. ПМЦ 1360284 . ПМИД  16449200. 
  10. ^ Бреслауер, К.Дж.; Фрэнк, Р; Блёкер, Х; Марки, Луизиана; и другие. (1986). «Прогнозирование стабильности дуплекса ДНК на основе базовой последовательности». Учеб. Натл. акад. наук. США . 83 (11): 3746–3750. Бибкод : 1986PNAS...83.3746B. дои : 10.1073/pnas.83.11.3746 . ПМК 323600 . ПМИД  3459152. (pdf) [ постоянная мертвая ссылка ]
  11. ^ Рычлик, В.; Спенсер, WJ; Роудс, RE (1990). «Оптимизация температуры отжига для амплификации ДНК in vitro». Нуклеиновые кислоты Рез . 18 (21): 6409–6412. дои : 10.1093/нар/18.21.6409. ПМК 332522 . ПМИД  2243783. 
  12. ^ Овзарзи Р.; Валлоне ПМ; Галло Ф.Дж.; Панер ТМ; Лейн М.Дж.; Бенайт А.С. (1997). «Прогнозирование стабильности плавления коротких дуплексных ДНК-олигомеров в зависимости от последовательности». Биополимеры . 44 (3): 217–239. doi :10.1002/(SICI)1097-0282(1997)44:3<217::AID-BIP3>3.0.CO;2-Y. ПМИД  9591477.(pdf)
  13. ^ abc Джон СантаЛюсия младший (1998). «Единый взгляд на термодинамику ближайших соседей полимера, гантели и олигонуклеотидной ДНК». Учеб. Натл. акад. наук. США . 95 (4): 1460–5. Бибкод : 1998PNAS...95.1460S. дои : 10.1073/pnas.95.4.1460 . ЧВК 19045 . ПМИД  9465037. 
  14. ^ Джон СантаЛюсия младший, Джон; Дональд Хикс (июнь 2004 г.). «Термодинамика структурных мотивов ДНК». Ежегодный обзор биофизики и биомолекулярной структуры . 33 : 415–440. doi :10.1146/annurev.biophys.32.110601.141800. ПМИД  15139820.
  15. ^ Хойбергс, Дж.; Ван Хуммелен, П.; Карлон, Э. (2009). «Влияние несовпадений на гибридизацию в микрочипах ДНК: определение параметров ближайшего соседа». Исследования нуклеиновых кислот . 37 (7): е53. дои : 10.1093/nar/gkp109. ПМЦ 2673445 . ПМИД  19270064. 
  16. ^ аб Хадивикарта, WW; Уолтер, Джей Си; Хойбергс, Дж.; Карлон, Э. (2012). «Изучение параметров гибридизации на основе экспериментов на микрочипах: модель ближайшего соседа и не только». Исследования нуклеиновых кислот . 40 (18): е138. arXiv : 1211.1303 . дои : 10.1093/nar/gks475. ПМК 3467032 . ПМИД  22661582. 
  17. ^ Уге, Ж.М.; Бизарро, резюме; Форнс, Н.; Смит, С.Б.; Бустаманте, К.; Риторт, Ф. (2010). «Одномолекулярное получение свободных энергий солезависимых пар оснований в ДНК». Учеб. Натл. акад. наук. США . 107 (35): 15431–6. arXiv : 1010.1188 . Бибкод : 2010PNAS..10715431H. дои : 10.1073/pnas.1001454107 . ПМЦ 2932562 . ПМИД  20716688. 

Внешние ссылки

Библиотечные ресурсы о
гибридизации нуклеиновых кислот
  • Ресурсы в вашей библиотеке
  • Ресурсы в других библиотеках