stringtranslate.com

Генетический скрининг

Генетический скрининг или скрининг мутагенеза — это экспериментальный метод, используемый для идентификации и отбора особей, обладающих интересующим фенотипом в мутагенизированной популяции. [1] Следовательно, генетический скрининг — это тип фенотипического скрининга . Генетические скрининги могут предоставить важную информацию о функции генов , а также о молекулярных событиях, лежащих в основе биологического процесса или пути. В то время как геномные проекты выявили обширный перечень генов во многих различных организмах, генетические скрининги могут предоставить ценную информацию о том, как функционируют эти гены. [2] [3] [4] [5] [6]

Базовый скрининг

Прямая генетика (или прямой генетический скрининг) начинается с фенотипа, а затем пытается определить причинную мутацию и, таким образом, ген(ы), ответственные за фенотип. Например, известный скрининг Кристианы Нюсляйн-Фольхард и Эрика Вишауса мутагенизировал плодовых мушек, а затем намеревался найти гены, вызывающие наблюдаемые мутантные фенотипы. [7]

Успешные прямые генетические скрининги часто требуют определенного генетического фона и простой экспериментальной процедуры. То есть, когда мутагенезируют несколько особей, они должны быть генетически идентичны, чтобы их фенотип дикого типа был также идентичен, а мутантные фенотипы было легче идентифицировать. Простой метод скрининга позволяет скрининговать большее количество особей, тем самым увеличивая вероятность генерации и идентификации интересующих мутантов. [3]

Поскольку естественные аллельные мутации редки, перед скринингом генетики часто мутагенезируют популяцию особей, подвергая их воздействию известного мутагена , например, химического вещества или радиации, тем самым генерируя гораздо более высокую частоту хромосомных мутаций . [1] В некоторых организмах мутагены используются для проведения скрининга насыщения , то есть скрининга, используемого для выявления всех генов, вовлеченных в определенный фенотип. Кристиана Нюсляйн-Фольхард и Эрик Вишаус были первыми людьми, которые выполнили этот тип процедуры скрининга на животных. [8]

Обратная генетика (или обратный генетический скрининг) начинается с известного гена и анализирует эффект его нарушения, анализируя полученные фенотипы. Например, при скрининге с нокаутом один или несколько генов полностью удаляются, а мутанты с делецией тестируются на фенотипы. Такие скрининги проводились для всех генов многих бактерий и даже сложных организмов, таких как C. elegans . [1] Обратный генетический скрининг обычно начинается с последовательности генов, за которой следует целенаправленная инактивация. [9] Более того, он вызывает мутации в модельных организмах, чтобы узнать их роль в заболевании. [10] Обратная генетика также используется для предоставления чрезвычайно точной статистики по мутациям, которые происходят в определенных генах. С помощью этих скринингов вы можете определить, насколько случайны мутации и как часто они происходят. [11]

Варианты скрининга

Было разработано множество вариантов скрининга для выявления гена, который приводит к интересующему мутантному фенотипу.

Усилитель

Скрининг энхансеров начинается с мутантного индивидуума, у которого есть затронутый интересующий процесс с известной мутацией гена. Затем скрининг может быть использован для идентификации дополнительных генов или мутаций генов, которые играют роль в этом биологическом или физиологическом процессе. Скрининг генетических энхансеров выявляет мутации, которые усиливают интересующий фенотип у уже мутантного индивидуума. Фенотип двойного мутанта (индивидуума как с энхансером, так и с исходной фоновой мутацией) более выражен, чем любой из фенотипов одиночного мутанта. Усиление должно превосходить ожидаемые фенотипы двух мутаций по отдельности, и поэтому каждая мутация может считаться усилителем другой. Изоляция энхансерных мутантов может привести к идентификации взаимодействующих генов или генов, которые действуют избыточно по отношению друг к другу. [12]

Подавитель

Скрининг супрессоров используется для выявления супрессорных мутаций , которые смягчают или возвращают фенотип исходной мутации в процессе, определяемом как синтетическая жизнеспособность . [13] Супрессорные мутации можно описать как вторые мутации в месте на хромосоме, отличном от изучаемой мутации, которые подавляют фенотип исходной мутации. [14] Если мутация находится в том же гене, что и исходная мутация, она известна как внутригенная супрессия , тогда как мутация, расположенная в другом гене, известна как внегенная супрессия или межгенная супрессия . [1] Супрессорные мутации чрезвычайно полезны для определения функций биохимических путей внутри клетки и взаимосвязей между различными биохимическими путями.

Чувствителен к температуре

Температурно -чувствительный скрининг включает в себя выполнение температурных сдвигов для улучшения мутантного фенотипа. Популяция, выращенная при низких температурах, будет иметь нормальный фенотип; однако мутация в конкретном гене сделает его нестабильным при более высокой температуре. Например, скрининг температурной чувствительности у плодовых мушек может включать повышение температуры в клетке до тех пор, пока некоторые мухи не потеряют сознание, а затем открытие портала, чтобы позволить другим сбежать. Особи, отобранные в скрининге, склонны нести необычную версию гена, вовлеченного в интересующий фенотип. Преимущество аллелей, обнаруженных в этом типе скрининга, заключается в том, что мутантный фенотип является условным и может быть активирован простым повышением температуры. Нулевая мутация в таком гене может быть летальной для эмбриона, и такие мутанты будут пропущены в базовом скрининге. Известный температурно-чувствительный скрининг был проведен независимо Ли Хартвеллом и Полом Нерсом для выявления мутантов, дефектных в клеточном цикле у S. cerevisiae и S. pombe соответственно.

РНК-интерференция

Обзор метода эмбриональной инъекции РНК-интерференции (РНКi)

Скрининг РНК-интерференции (РНКi) по сути является прямым генетическим скринингом с использованием метода обратной генетики. Подобно классическим генетическим скринингам в прошлом, успех крупномасштабных исследований РНКi зависит от тщательной разработки фенотипических анализов и их интерпретации. [9] В Drosophila РНКi применялась в культивируемых клетках или in vivo для исследования функций генов и воздействия на функцию отдельных генов в масштабе всего генома. РНКi используется для подавления экспрессии генов у Drosophila путем инъекции dsRNA в ранние эмбрионы и вмешательства в гены Frizzled и Frizzled2, создавая дефекты в эмбриональном паттерне, которые имитируют потерю функции бескрылости. [15]

КРИСПР

Cas12a в комплексе с crRNA и целевой ДНК — ключевой инструмент для скрининга CRISPR

CRISPR/Cas в основном используется для обратных генетических скринингов. CRISPR способен создавать библиотеки тысяч точных генетических мутаций и может идентифицировать новые опухоли, а также проверять старые опухоли в исследованиях рака. Библиотека нокаутов CRISPR-Cas9 геномного масштаба (GeCKO), нацеленная на 18 080 генов с 64 751 уникальной направляющей последовательностью, идентифицирует гены, необходимые для жизнеспособности клеток при раке. Бактериальная система CRISPR–Cas9 для проектирования мутаций потери функции (LOF) и приобретения функции (GOF) в нетрансформированных кишечных органоидах человека с целью демонстрации модели колоректального рака (CRC) . Ее также можно использовать для изучения функциональных последствий мутаций in vivo, обеспечивая прямое редактирование генома в соматических клетках. [10]

Картографирование мутантов

Согласно классическому генетическому подходу, исследователь затем находит (картирует) ген на его хромосоме путем скрещивания с особями, которые несут другие необычные черты , и собирает статистику о том, как часто эти две черты наследуются вместе. Классические генетики использовали бы фенотипические черты для картирования новых мутантных аллелей . С появлением геномных последовательностей для модельных систем, таких как Drosophila melanogaster , Arabidopsis thaliana и C. elegans , теперь было идентифицировано много однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), которые можно использовать в качестве признаков для картирования. Фактически, Гейдельбергский скрининг , позволяющий проводить массовое тестирование мутантов и разработанный в 1980 году Нюслейн-Фольхардом и Вишаусом , расчистил путь для будущих ученых в этой области. [4] SNP являются предпочтительными признаками для картирования, поскольку они очень часты, порядка одного различия на 1000 пар оснований, между различными разновидностями организмов. Мутагены, такие как случайные вставки ДНК путем трансформации или активные транспозоны, также могут быть использованы для создания новых мутантов. Эти методы имеют преимущество в том, что они маркируют новые аллели известным молекулярным (ДНК) маркером , который может способствовать быстрой идентификации гена. [8]

Позиционное клонирование

Позиционное клонирование — это метод идентификации генов, при котором ген для определенного фенотипа идентифицируется только по его приблизительному расположению на хромосоме (но не по функции); это известно как область-кандидат . Первоначально область-кандидат может быть определена с помощью таких методов, как анализ сцепления , а затем позиционное клонирование используется для сужения области-кандидата до тех пор, пока не будут найдены ген и его мутации. Позиционное клонирование обычно включает в себя изоляцию частично перекрывающихся сегментов ДНК из геномных библиотек для продвижения по хромосоме к определенному гену. В ходе позиционного клонирования необходимо определить, является ли рассматриваемый в данный момент сегмент ДНК частью гена.

Тесты, используемые для этой цели, включают в себя кросс-видовую гибридизацию, идентификацию неметилированных CpG-островков , захват экзонов , прямой выбор кДНК , компьютерный анализ последовательности ДНК, скрининг мутаций у затронутых лиц и тесты экспрессии генов. Для геномов, в которых известны области генетических полиморфизмов , позиционное клонирование включает в себя идентификацию полиморфизмов, которые фланкируют мутацию. Этот процесс требует, чтобы фрагменты ДНК из ближайшего известного генетического маркера постепенно клонировались и секвенировались, приближаясь к мутантному аллелю с каждым новым клоном. Этот процесс создает карту контигов локуса и известен как прогулка по хромосоме . С завершением проектов по секвенированию генома, таких как проект «Геном человека» , современное позиционное клонирование может использовать готовые контиги из баз данных последовательностей генома напрямую .

Для каждого нового клона ДНК полиморфизм идентифицируется и тестируется в картирующей популяции на предмет частоты рекомбинации по сравнению с мутантным фенотипом. Когда клон ДНК находится на уровне или близко к мутантному аллелю, частота рекомбинации должна быть близка к нулю. Если прогулка по хромосоме продолжается через мутантный аллель, новые полиморфизмы начнут демонстрировать увеличение частоты рекомбинации по сравнению с мутантным фенотипом. В зависимости от размера картирующей популяции мутантный аллель может быть сужен до небольшой области (<30 Кб). Затем требуется сравнение последовательностей между диким типом и мутантной ДНК в этой области, чтобы найти мутацию ДНК , которая вызывает фенотипическое различие.

Современное позиционное клонирование может более непосредственно извлекать информацию из проектов геномного секвенирования и существующих данных, анализируя гены в регионе-кандидате. Затем потенциальные гены болезней из региона-кандидата могут быть приоритизированы, что потенциально сокращает объем работы. Гены с паттернами экспрессии, соответствующими фенотипу болезни, показывающие (предполагаемую) функцию, связанную с фенотипом, или гомологичные другому гену, связанному с фенотипом, являются приоритетными кандидатами. Обобщение методов позиционного клонирования таким образом также известно как позиционное обнаружение генов.

Позиционное клонирование является эффективным методом для выделения генов болезней беспристрастным образом и было использовано для идентификации генов болезней мышечной дистрофии Дюшенна , болезни Хантингтона и муковисцидоза . Однако осложнения в анализе возникают, если заболевание проявляет гетерогенность локуса.

Ссылки

  1. ^ abcd Hartwell LH, Hood L, Goldberg ML, Reynolds AE, Silver LM, Veres RC (2008). Генетика: от генов к геномам . Бостон: McGraw-Hill Higher Education. ISBN 978-0-07-284846-5.
  2. ^ Patton EE, Zon LI (декабрь 2001 г.). «Искусство и дизайн генетических экранов: данио-рерио». Nature Reviews. Genetics . 2 (12): 956–966. doi :10.1038/35103567. PMID  11733748. S2CID  3166016.
  3. ^ ab Page DR, Grossniklaus U (февраль 2002 г.). «Искусство и дизайн генетических экранов: Arabidopsis thaliana». Nature Reviews. Genetics . 3 (2): 124–136. doi :10.1038/nrg730. PMID  11836506. S2CID  431110.
  4. ^ ab St Johnston D (март 2002 г.). «Искусство и дизайн генетических экранов: Drosophila melanogaster». Nature Reviews. Genetics . 3 (3): 176–188. doi :10.1038/nrg751. PMID  11972155. S2CID  195368351.
  5. ^ Йоргенсен EM, Манго SE (май 2002). «Искусство и дизайн генетических экранов: caenorhabditis elegans». Nature Reviews. Генетика . 3 (5): 356–369. doi :10.1038/nrg794. PMID  11988761. S2CID  152517.
  6. ^ Касселтон Л., Золан М. (сентябрь 2002 г.). «Искусство и дизайн генетических экранов: нитчатые грибы». Nature Reviews. Genetics . 3 (9): 683–697. doi :10.1038/nrg889. PMID  12209143. S2CID  11744977.
  7. ^ Nüsslein-Volhard C, Wieschaus E (октябрь 1980 г.). «Мутации, влияющие на количество сегментов и полярность у дрозофилы». Nature . 287 (5785): 795–801. Bibcode :1980Natur.287..795N. doi :10.1038/287795a0. PMID  6776413. S2CID  4337658.
  8. ^ ab "Genetic Screen". Stem Cells Research. Архивировано из оригинала 2012-04-01 . Получено 2012-05-03 .
  9. ^ ab Boutros M, Ahringer J (июль 2008 г.). «Искусство и дизайн генетических экранов: РНК-интерференция». Nature Reviews. Genetics . 9 (7): 554–566. doi :10.1038/nrg2364. PMID  18521077. S2CID  12787125.
  10. ^ ab Gurumurthy CB, Grati M, Ohtsuka M, Schilit SL, Quadros RM, Liu XZ (сентябрь 2016 г.). «CRISPR: универсальный инструмент для исследований прямой и обратной генетики». Генетика человека . 135 (9): 971–976. doi :10.1007/s00439-016-1704-4. PMC 5002245. PMID  27384229 . 
  11. ^ Greene EA, Codomo CA, Taylor NE, Henikoff JG, Till BJ, Reynolds SH и др. (июнь 2003 г.). «Спектр химически индуцированных мутаций из крупномасштабного обратного генетического скрининга у Arabidopsis». Genetics . 164 (2): 731–740. doi :10.1093/genetics/164.2.731. PMC 1462604 . PMID  12807792. 
  12. ^ Herman RK, Yochem J (сентябрь 2005 г.). «Генетические усилители». WormBook : 1–11. doi :10.1895/wormbook.1.27.1. PMC 4780930 . PMID  18023119. 
  13. ^ Пудду Ф, Оэльшлегель Т, Герини И, Гейслер Нью-Джерси, Ниу Х, Херцог М и др. (июнь 2015 г.). «Геномный скрининг синтетической жизнеспособности определяет функцию Sae2 в репарации ДНК». Журнал ЭМБО . 34 (11): 1509–1522. дои : 10.15252/embj.201590973. ПМЦ 4474527 . ПМИД  25899817. 
  14. ^ Hodgkin J (декабрь 2005 г.). «Генетическое подавление». WormBook : 1–13. doi :10.1895/wormbook.1.59.1. PMC 4781008 . PMID  18023120. 
  15. ^ Heigwer F, Port F, Boutros M (март 2018 г.). «Скрининг РНК-интерференции (РНКi) у дрозофилы». Genetics . 208 (3): 853–874. doi :10.1534/genetics.117.300077. PMC 5844339 . PMID  29487145. 

Внешние ссылки