Резилин представляет собой эластомерный белок , обнаруженный у многих насекомых и других членистоногих. Придает мягкую резиноэластичность механически активным органам и тканям; например, он позволяет насекомым многих видов эффективно прыгать или поворачивать крылья. Резилин был впервые обнаружен Торкелем Вейс-Фогом в шарнирах крыльев саранчи.
Резилин в настоящее время является наиболее эффективным известным эластичным белком (Elvin et al., 2005). Сообщается, что эластичная эффективность резилина, выделенного из сухожилий саранчи , составляет 97% (только 3% запасенной энергии теряется в виде тепла). Он не имеет какой-либо регулярной структуры, но его хаотично свернутые цепи сшиты ди- и тритирозиновыми звеньями на нужном расстоянии, чтобы придать эластичность , необходимую для перемещения некоторых прыгающих насекомых на расстояния, в 38 раз превышающие их длину (как это обнаружено у блох). Резилин должен сохраняться на протяжении всей жизни взрослых насекомых и, следовательно, должен действовать в течение сотен миллионов расширений и сокращений ; его эластичная эффективность обеспечивает работоспособность на протяжении всей жизни насекомого. Резилин демонстрирует необычное эластомерное поведение только при набухании в полярных растворителях, таких как вода.
В 2005 году была синтезирована рекомбинантная форма белка резилина мухи Drosophila melanogaster путем экспрессии части гена мухи в бактерии Escherichia coli . Активные исследования изучают потенциальное применение рекомбинантных резилинов в биомедицинской инженерии и медицине.
После открытия в эластичных сухожилиях стрекоз и шарнирах крыльев саранчи резилин был обнаружен во многих структурах и органах членистоногих . [1] Резилин часто встречается в виде соединения с хитином в кутикуле насекомых , где хитин служит структурным компонентом. Резилин обеспечивает эластичность и, возможно, другие свойства. Он был обнаружен в слюнном насосе клопов-убийц ( Rhodnius prolixus ), мух цеце и медоносных пчел , а также в механизме обеспечения устойчивости насоса, распределяющего яд, в жалах медоносных пчел . Резилин также был обнаружен в органах производства звука членистоногих, таких как цикады и бабочки семейства Pyralidae , где высокая эластичность и высокая устойчивость резилина играют важную роль из-за быстрых циклов снятия стресса в барабанных перепонках , производящих звук . Помимо этих структур, резилин наиболее широко распространен в двигательных системах членистоногих. Было обнаружено, что в шарнирах крыла он позволяет восстанавливаться после деформации элементов крыла и гасить аэродинамические силы, испытываемые крылом; в амбулаторных системах тараканов и мух для облегчения быстрой деформации суставов; в прыжковых механизмах резилин с большой эффективностью сохраняет кинетическую энергию и высвобождает ее при разгрузке. Его также много в кутикуле, окружающей брюшко термитов, муравьев и пчел, которая сильно раздувается и раздувается в процессе питания и размножения. [1]
Аминокислотный состав резилина был проанализирован в 1961 году Бейли и Торкелем Вейс-Фогом, когда они наблюдали образцы преалярных конечностей и шарнирных связок крыльев саранчи. Результат показывает, что в аминокислотном составе резилина отсутствуют компоненты метионин , гидроксипролин и цистеин . [2]
Было идентифицировано, что резилин является продуктом гена CG15920 Drosophila melanogaster из-за сходства аминокислотного состава резилина и продукта гена. [3] Ген Drosophila melanogaster состоит из 4 экзонов , которые кодируют 4 функциональных сегмента в CG15920: сигнальный пептид и 3 пептида, кодируемые экзонами 1, 2 и 3. [4] Сигнальный пептид направляет прорезилин во внеклеточное пространство. , где белки резилина агрегируют и перекрестно сшиваются, образуя сеть, а затем отрезаются от пептидов, так что зарождающийся резилин становится зрелым резилином. С N-конца сегмент, кодируемый экзоном 1, содержит 18 копий повторяющейся последовательности из 15 остатков (GGRPSDSYGAPGGGN); сегмент, соответствующий экзону 2, содержит 62 аминокислоты хитинсвязывающей консенсусной последовательности Реберса-Риддифорда (RR) ( Pfam PF00379); В пептиде, кодируемом экзоном 3, доминируют 11 копий 13-остаточной повторяющейся последовательности (GYSGGRPGGQDLG). В то время как обогащенный глицин и пролин в экзоне 1 и 3 вводят в белок циклические структуры, остатки тирозина способны образовывать ди- и тритирозиновые поперечные связи между белками.
Резилин представляет собой неупорядоченный белок; однако его сегменты могут приобретать вторичные структуры в разных условиях. Обнаружено, что пептидная последовательность, кодируемая экзоном 1, имеет неструктурированную форму и не может быть кристаллизована, что позволяет сегменту пептидной последовательности быть очень мягким и очень гибким. Пептид, кодируемый экзоном 3, принимает неструктурированную форму перед загрузкой, но трансформируется в упорядоченную структуру с бета-поворотом при воздействии стресса. Между тем сегмент, кодируемый экзоном 2, служит хитинсвязывающим доменом. [4] Предполагается, что при приложении стресса или при подаче энергии пептид, кодируемый экзоном 1, реагирует немедленно благодаря своей высокой гибкости. Как только это происходит, энергия передается на пептид, кодируемый экзоном 3, который трансформируется из неструктурированной формы в структуру бета-поворота для хранения энергии. Как только стресс или энергия удаляются, сегмент, кодируемый экзоном 3, обращает структурную трансформацию вспять и передает энергию сегменту, кодируемому экзоном 1. [4]
Другая вторичная структура, которую могут иметь пептиды, соответствующие экзону 1 и экзону 3, - это полипролиновая спираль (PPII), о чем свидетельствует высокое содержание пролина и глицина в этих двух сегментах. Структура PPII широко распространена в эластомерных белках, таких как абдуктин , эластин и тайтин . [5] Считается, что он способствует процессу самосборки и эластичности белка. [4] Предполагается, что упругий механизм резилина связан с энтропией . В расслабленном состоянии пептид сворачивается и обладает большой энтропией, но как только он растягивается, энтропия уменьшается по мере разворачивания пептида. Сосуществование PPII и бета-поворота играет важную роль в увеличении энтропии, поскольку резилин возвращается к своей неупорядоченной форме. [6] Другая функция PPII заключается в облегчении процесса самосборки: обнаружено, что квазирасширенный PPII способен взаимодействовать посредством межмолекулярной реакции и инициировать образование фибриллярной супрамолекулярной структуры. [6]
В то время как вторичные структуры определяются энергетическим состоянием и водородными связями, образующимися между аминокислотами, иерархические структуры определяются гидрофобностью пептида . Пептид, кодируемый экзоном 1, в основном гидрофильен и более удлиняется при погружении в воду. [7] Напротив, пептид, кодируемый экзоном 3, содержит как гидрофобные, так и гидрофильные блоки, что предполагает образование мицелл, где гидрофобный блок будет группироваться внутри с окружающей его гидрофильной частью. [7] Таким образом, один полный белок резилин при погружении в воду принимает структуру, в которой сегмент, кодируемый экзоном 1, выходит из мицеллярных пептидных форм, кодируемых экзоном 3. [7]
Как только резилин переносится за пределы клетки, его пептиды, кодируемые экзоном 2, хитин-связывающие сегменты, связываются с хитином. [1] Между тем, сшивание ди- или тритирозина образуется путем окислительного связывания , опосредованного пероксидазой , между остатками тирозина . [1] Как и в других эластомерных белках, степень поперечных связей в резилине низкая, что обеспечивает низкую жесткость и высокую упругость. Сшитые пептиды, кодируемые экзоном 1, имеют устойчивость более 93%, тогда как пептиды, кодируемые экзоном 3, имеют устойчивость 86%. Кроме того, природный резилин имеет упругость 92%, аналогичную упругости экзона 1, что еще раз позволяет предположить, что экзон 1 может играть более важную роль в эластичных свойствах резилина. [4]
Андерсен в 1996 году обнаружил, что остатки тирозина участвуют в химически ковалентных поперечных связях во многих формах, таких как дитирозин , тритирозин и тетратирозин. [8] Прежде всего, в резилине тирозин и дитирозин служили химическими поперечными связями , в которых R-группы тирозина и дитирозина присоединяются к основной цепи растущей пептидной цепи. [1] Андерсен пришел к такому выводу на основе исследования этих двух соединений, в ходе которого он смог исключить другие формы поперечных связей, такие как дисульфидные мостики, сложноэфирные группы и амидные связи. [1] Хотя механизм сшивания тирозина понятен и происходит посредством радикальной инициации, сшивание резилина до сих пор остается загадкой. Сшивание резилина происходит очень быстро и, возможно, это результат температуры. При повышении температуры скорость сшивания остатков увеличивается и приводит к образованию сильно сшитой сетки резилина. [1]
Аминокислотный состав резилина указывает на то, что пролин и глицин имеют относительно высокое присутствие в аминокислотном составе резилина. Присутствие глицина и пролина в составе резилина во многом способствует эластичности резилина. [9] Однако в резилине отсутствует альфа-спираль, что приводит к хаотичной спиральной структуре и неупорядоченной структуре. [10] Это связано, прежде всего, со значительно высоким содержанием пролина в резилине. Пролин представляет собой объемистую аминокислоту, которая способна вызывать перекручивание пептидной цепи и из-за пространственно затрудненных боковых цепей не может помещаться в альфа-спирали. Однако сегменты резилина способны принимать формы вторичной структуры в разных условиях.
Как и другие биоматериалы, резилин представляет собой гидрогель , то есть набухает под действием воды. Содержание воды в резилине при нейтральном pH составляет 50-60%, и отсутствие этой воды сильно влияет на свойства материала: гидратированный резилин ведет себя как каучук, а дегидратированный резилин обладает свойствами стеклообразного полимера. [1] Однако обезвоженный резилин способен вернуться в свое эластичное состояние при наличии воды. Вода служит пластификатором в резилиновой сетке за счет увеличения количества водородных связей. [4] Высокая концентрация пролина и глицина, полипролиновых спиралей и гидрофильных частей способствуют увеличению содержания воды в белковой сети резилина. Увеличение водородных связей приводит к увеличению подвижности цепи, вследствие чего снижается температура стеклования . Чем больше воды содержится в сетке резилина, тем менее жестким и более эластичным является материал. Дегидратированный резилин ведет себя как стеклополимер с низкой жесткостью, деформацией и упругостью, но с относительно высоким модулем сжатия и температурой стеклования. [1]
Каучукоподобные белки, такие как резилин и эластин, характеризуются высокой эластичностью , низкой жесткостью и большой деформируемостью . [11] Высокая устойчивость указывает на то, что достаточное количество введенной энергии может храниться в материале и впоследствии высвобождаться. Примером затрат энергии является растяжение материала. Природный резилин (гидратированный) имеет устойчивость 92%, что означает, что он может хранить 92% поступившей энергии для высвобождения во время разгрузки, что указывает на очень эффективную передачу энергии. Чтобы лучше понять жесткость и деформацию резилина, следует принять во внимание закон Гука. Для линейных пружин закон Гука гласит, что сила, необходимая для деформации пружины, прямо пропорциональна величине деформации на константу, которая является характеристикой пружины. Материал считается упругим, если его можно деформировать в значительной степени при ограниченном усилии. Гидратированный резилин имеет модуль растяжения 640–2000 кПа, модуль неограниченного сжатия 600–700 кПа и предел прочности при разрыве 300%. [4]
Хотя фактических данных по усталостному сроку службы резилина не было получено, мы можем думать об этом интуитивно. Если мы рассмотрим случай медоносных пчел, где они живут около 8 недель, в течение которых летают по 8 часов в день, взмахивая крыльями со скоростью 720 000 циклов в час, они, вероятно, взмахнут крыльями более 300 миллионов раз [9]. Поскольку резилин функционирует на протяжении всей жизни насекомых, его усталостный срок службы должен быть значительно большим. Однако у живых насекомых молекула резилина может постоянно производиться и заменяться, что вносит ошибку в наш вывод.
Благодаря замечательной каучуковой эластичности резилина ученые начали исследовать рекомбинантные версии для различных материалов и медицинских применений. С развитием технологий ДНК в этой области исследований наблюдается быстрый рост синтеза биосинтетических белковых полимеров, которые можно настроить на наличие определенных механических свойств. Таким образом, эта область исследований весьма перспективна и может предоставить новые методы лечения заболеваний и расстройств, поражающих население. Рекомбинантный резилин был впервые изучен в 2005 году, когда он был экспрессирован в Escherichia coli из первого экзона гена CG15920 Drosophila Melanogaster . [12] В ходе исследования чистый резилин был синтезирован в 20%-ный гидрогель по массе белка и сшит с тирозином, катализируемым рутением, в присутствии ультрафиолетового света. [12] Эта реакция дала продукт, рекомбинантный резилин (rec1-Resilin). [12]
Одним из наиболее важных аспектов успешного синтеза Rec1-резилина является то, что его механические свойства соответствуют свойствам исходного резилина (нативного резилина). В указанном выше исследовании для исследования механических свойств Rec1-резилина и нативного резилина использовались сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) и атомно-силовая микроскопия (АСМ). [1] Результаты этих испытаний показали, что устойчивость как рекомбинантного, так и нативного резилина относительно одинакова, но может различаться при его применении. [1] В этом исследовании Rec1-Resilin может быть помещен в полимерный каркас для имитации внеклеточного матрикса и генерации реакций клеток и тканей. Хотя эта область исследований все еще продолжается, она вызвала широкий интерес в научном сообществе и в настоящее время исследуется для различных биомедицинских применений в областях регенерации и восстановления тканей.
Одним из уникальных свойств Rec1-резилина является его способность идентифицироваться благодаря автофлуоресценции. Флуоресценция резилина обусловлена главным образом дитирозином, который образуется в результате сшивки остатков тирозина. Когда ультрафиолетовый свет облучает образец Rec1-Resilin с длиной волны от 315 до 409 нм, Rec1-Resilin начинает проявлять синюю флуоресценцию. [12] Пример синей флуоресценции, проявляемой остатками дитирозина в резилине, показан на рисунке ниже, изображающем блоху.
Еще одним уникальным свойством резилина является его высокая устойчивость. Рекомбинантный резилин продемонстрировал превосходные механические свойства, аналогичные свойствам чистого резилина. Элвин и др. Целью исследования было сравнить устойчивость Rec1-Resilin с другими каучуками, при этом использовался сканирующий зондовый микроскоп . В этом исследовании сравнивалась устойчивость Rec1-Resilin к двум различным типам каучука: хлорбутилкаучуку и полибутадиеновому каучуку, оба каучука обладают высокими эластичными свойствами. [12] Это исследование пришло к выводу, что resilin был на 92% эластичнее по сравнению с хлорбутиловым каучуком на 56% и полибутадиеновым каучуком на 80% соответственно. [12] Благодаря такой высокой механической устойчивости свойства Rec1-Resilin могут быть применены и для других клинических применений в области материаловедения и медицины. Это исследование рекомбинантного резилина привело к нескольким годам исследований по использованию резилиноподобных белков для нескольких биомедицинских применений, которые сохраняют механические свойства резилина. Текущие результаты исследований с использованием рекомбинантного резилина могут привести к дальнейшим исследованиям, в которых могут быть изучены другие неизученные механические свойства и химическая структура резилина.
Рекомбинантные резилины изучались на предмет потенциального применения в области биомедицинской инженерии и медицины. В частности, гидрогели , состоящие из рекомбинантных резилинов, использовались в качестве каркасов для тканевой инженерии механически активных тканей, включая ткани сердечно-сосудистой системы, хрящей и голосовых связок. Ранние работы были сосредоточены на оптимизации механических свойств, химии и цитосовместимости этих материалов, но также были проведены некоторые испытания гидрогелей резилина in vivo . [13] Исследователи из Университета Делавэра и Университета Пердью разработали методы создания эластичных гидрогелей, состоящих из резилина, которые были совместимы со стволовыми клетками и демонстрировали эластичность каучука , аналогичную эластичности натурального резилина. [14] [15] [16] [17] Также сообщалось о полусинтетических гидрогелях на основе резилина, которые включают поли(этиленгликоли) . [18]
