Рибонуклеотидредуктаза ( RNR ), также известная как рибонуклеозиддифосфатредуктаза , является ферментом , который катализирует образование дезоксирибонуклеотидов из рибонуклеотидов . [1] [2] Он катализирует это образование путем удаления 2'-гидроксильной группы рибозного кольца нуклеозиддифосфатов (или трифосфатов в зависимости от класса RNR). Это восстановление производит дезоксирибонуклеотиды. [3] Дезоксирибонуклеотиды, в свою очередь, используются в синтезе ДНК . Реакция, катализируемая RNR, строго сохраняется во всех живых организмах. [4] Кроме того, RNR играет важную роль в регулировании общей скорости синтеза ДНК, так что соотношение ДНК и клеточной массы поддерживается на постоянном уровне во время деления клеток и репарации ДНК . [5] Несколько необычной особенностью фермента RNR является то, что он катализирует реакцию, которая протекает через свободнорадикальный механизм действия. [6] [7] Субстратами для РНР являются АДФ , ГДФ , ЦДФ и УДФ . ДТДФ (дезокситимидиндифосфат) синтезируется другим ферментом ( тимидилаткиназой ) из дТМФ (дезокситимидинмонофосфата).
Рибонуклеотидредуктазы делятся на три класса. Ферменты класса I RNR состоят из большой альфа-субъединицы и малых бета-субъединиц, которые связываются, образуя активный гетеродимерный тетрамер . Восстанавливая NDP до 2'-dNDP, фермент катализирует синтез de novo дезоксирибонуклеотидов (dNTP), которые являются предшественниками синтеза ДНК и необходимы для пролиферации клеток . [8] Класс II RNR продуцирует 5'-дезоксиаденозильный радикал путем гомолитического расщепления связи C-Co в аденозилкобаламине. Кроме того, класс III RNR содержит стабильный глицильный радикал. [9]
У людей присутствуют RNR класса I. Альфа-субъединица кодируется геном RRM1, в то время как существуют две изоформы бета-субъединицы, кодируемые генами RRM2 и RRM2B:
Каждый альфа- мономер класса I состоит из трех доменов : [10]
В Pfam второй домен интерпретируется как два отдельных домена:
Бета-субъединица класса I обычно содержит диметаллический центр и стабильный тирозильный радикал . У людей бета-субъединица зависит от дижелезного кофактора. В E. coli тирозильный радикал расположен в позиции 122 (Y122), обеспечивая стабильный радикал для субъединиц RNR2 класса I. [14] В A. aegypti этот тирозильный радикал расположен в позиции 184 (Y184). [15] Тирозильный радикал глубоко скрыт внутри белка в гидрофобной среде, расположенной близко к железному центру, который используется для стабилизации тирозильного радикала. В структуре двух μ-оксо-связанных желез доминируют лиганды, которые служат сайтами связывания железа: четыре карбоксилата [ аспартат (D146), глутамат (E177, E240 и E274)] и два гистидина (H180 и H277). [15] Ассоциация происходит между C-концом RNR2 и C-концом RNR1. [10] Ферментативная активность зависит от ассоциации субъединиц RNR1 и RNR2. Активный сайт состоит из активных дитиольных групп из RNR1, а также диферрикового центра и тирозильного радикала из субъединицы RNR2.
Другие остатки RNR2, такие как аспартат (D273), триптофан (W48) и тирозин (Y356), дополнительно стабилизируют тирозильный радикал активного центра, тем самым обеспечивая перенос электронов. [10] Эти остатки помогают в переносе радикального электрона с тирозина (Y122) RNR2 на цистеин (C439) RNR1. Перенос электронов начинается на тирозине RNR2 (Y122) и продолжается в RNR2 на триптофан (W48), который отделен от тирозина RNR1 (Y731) на 2,5 нанометра . Перенос электронов от RNR2 к RNR1 происходит через тирозин (Y356 на Y731) и продолжается через тирозин (Y730) на цистеин (C439) в активном центре. [16] Сайт-направленные мутации первичной структуры RNR указывают на то, что все остатки, указанные выше, участвуют в переносе свободного радикала на большие расстояния к активному сайту. [10]
У комаров A. aegypti RNR1 сохраняет большинство важнейших аминокислотных остатков, включая аспартат (D64) и валин (V292 или V284), которые необходимы для аллостерической регуляции ; остатки пролина (P210 и P610), лейцина (L453 и L473) и метионина (M603), которые расположены в гидрофобном активном центре; остатки цистеина (C225, C436 и C451), которые участвуют в удалении атома водорода и переносе радикального электрона в активном центре; остатки цистеина (C225 и C436), аспарагина (N434) и глутамата (E441), которые связывают рибонуклеотидный субстрат; остатки тирозина (Y723 и Y743), которые определяют перенос радикала; и остатки цистеина (C838 и C841), которые используются при регенерации дитиоловых групп в активном центре. [15]
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae обладают минорной изоформой большой субъединицы рибонуклеотиддифосфатредуктазы под обозначением RNR3 или YIL066C на хромосоме IX дрожжей. [17] Это паралог дрожжевого RNR1 , который, вероятно, возник в результате дупликации целого генома . [18] Комплекс RNR катализирует этап , ограничивающий скорость, в синтезе dNTP , регулируемом репликацией ДНК и путями контрольных точек повреждения ДНК посредством локализации малых субъединиц.
Фермент рибонуклеотидредуктаза (РНР) катализирует синтез dNDP de novo. [19] Катализ рибонуклеозид-5'-дифосфатов (НРФ) включает восстановление на 2'-углероде рибозо-5-фосфата с образованием восстановленных 2'-дезоксипроизводных 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-дифосфатов (dNDP). Это восстановление инициируется генерацией свободного радикала. После одного восстановления РНР требуются электроны, полученные от дитиоловых групп белка тиоредоксина . Регенерация тиоредоксина происходит, когда никотинамидадениндинуклеотидфосфат ( НАДФН ) предоставляет два атома водорода, которые используются для восстановления дисульфидных групп тиоредоксина.
Три класса RNR имеют схожие механизмы восстановления NDP, но различаются по домену, который генерирует свободный радикал, конкретному металлу в структуре металлопротеина и донорам электронов. Все классы используют химию свободных радикалов. [10] Редуктазы класса I используют железный центр с преобразованием железа в железо для генерации тирозильного свободного радикала. Восстановление субстратов NDP происходит в аэробных условиях. Редуктазы класса I делятся на IA и IB из-за различий в регуляции. Редуктазы класса IA распространены в эукариотах , эубактериях , бактериофагах и вирусах . Редуктазы класса IB обнаружены в эубактериях. Редуктазы класса IB также могут использовать радикал, генерируемый при стабилизации биядерного марганцевого центра. Редуктазы класса II генерируют свободный радикал 5'-дезоксиаденозил из кобаламина (кофермент B12) и имеют более простую структуру, чем редуктазы класса I и класса III. Восстановление NDP или рибонуклеотид 5'-трифосфатов (NTP) происходит как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Редуктазы класса II распространены в архебактериях , эубактериях и бактериофагах. Редуктазы класса III используют радикал глицина, генерируемый с помощью S-аденозилметионина и железосерного центра. Восстановление NTP ограничено анаэробными условиями. Редуктазы класса III распространены в архебактериях, эубактериях и бактериофагах. [10] [15] Организмы не ограничиваются наличием одного класса ферментов. Например, у E. coli есть как класс I, так и класс III RNR.
Механизм, который в настоящее время принят для восстановления рибонуклеотидов до дезоксирибонуклеотидов, изображен на следующей схеме. Первый шаг включает в себя отщепление 3'-H субстрата 1 радикалом Cys439. Затем реакция включает в себя удаление одной молекулы воды от углерода C-2' рибонуклеотида, катализируемое Cys225 и Glu441. На третьем шаге происходит перенос атома водорода от Cys225 к углероду C-2' 2'-кетильного радикала 3, после предыдущего переноса протона от Cys462 к Cys225. В конце этого шага получают радикальный анионный дисульфидный мостик и промежуточный кетон с закрытой оболочкой 4. Этот промежуточный продукт был идентифицирован в ходе превращения нескольких 2'-замещенных аналогов субстрата, а также с природным субстратом [20], взаимодействующим с мутантами фермента. Следующий шаг — окисление анионного дисульфидного мостика с сопутствующим восстановлением субстрата, что приводит к образованию 5. Спиновая плотность смещается от атомов серы к атому C-3' субстрата с одновременным переносом протона от Glu441 к углероду C-3'. Последний шаг является обратным первому шагу и включает перенос водорода от Cys439 к C-3', что приводит к регенерации исходного радикала и получению конечного продукта 6.
Теоретические модели некоторых этапов этих механизмов с использованием полной модели белка R1 можно найти в исследованиях, выполненных Серкейрой и др . [21] [22]
Класс I RNR включает субъединицы RNR1 и RNR2, которые могут объединяться, образуя гетеродимерный тетрамер. [6] RNR1 содержит оба аллостерических сайта, опосредуя регуляцию субстратной специфичности и активности. [12] В зависимости от аллостерической конфигурации один из четырех рибонуклеотидов связывается с активным сайтом.
Регуляция RNR предназначена для поддержания сбалансированного количества dNTP. Связывание эффекторных молекул либо увеличивает, либо уменьшает активность RNR. Когда АТФ связывается с сайтом аллостерической активности, он активирует RNR. Напротив, когда dATP связывается с этим сайтом, он дезактивирует RNR. [10] Помимо контроля активности, аллостерический механизм также регулирует специфичность субстрата и гарантирует, что фермент производит равное количество каждого dNTP для синтеза ДНК. [10] Во всех классах связывание АТФ или dATP с аллостерическим сайтом вызывает восстановление цитидин-5'-дифосфата (CDP) и уридин-5'-дифосфата (UDP); 2'-дезоксигуанозин-5'-трифосфат (dGTP) вызывает восстановление аденозин-5'-дифосфата (ADP); и 2'-дезокситимидин 5'-трифосфат (dTTP) вызывает восстановление гуанозин 5'-дифосфата (GDP) (рисунок 1).
Редуктазы класса IB не ингибируются dATP, поскольку им не хватает приблизительно 50 N-концевых аминокислот, необходимых для сайта аллостерической активности. [23] Кроме того, важно, чтобы активность рибонуклеотидредуктазы находилась под транскрипционным и посттранскрипционным контролем, поскольку синтез неповрежденной ДНК зависит от сбалансированного пула дезоксирибонуклеотидов. [24] Эукариотические клетки с редуктазами класса IA имеют механизм отрицательного контроля для выключения синтеза dNTP по мере их накопления. Этот механизм защищает клетку от токсических и мутагенных эффектов, которые могут возникнуть из-за перепроизводства dNTP, поскольку изменения в сбалансированных пулах dNTP приводят к повреждению ДНК и гибели клетки. [25] [26] Хотя перепроизводство dNTP или несбалансированное их поступление может привести к неправильному включению нуклеотидов в ДНК, поступление dNTP может обеспечить восстановление ДНК. p53R2 — это небольшая субъединица рибонуклеотидредуктазы, которая может вызывать такое восстановление. Изменения в этом гомологе R2, индуцированном p53, могут вызывать истощение митохондриальной ДНК, и, следовательно, p53R2 служит основным фактором в поставке dNTP. [27]
РНР может использовать модель аллостерической регуляции морфеина . [28]
Обычно ингибиторы RNR класса I можно разделить на три основные группы: ингибиторы трансляции, которые блокируют синтез фермента; ингибиторы димеризации, которые предотвращают ассоциацию двух субъединиц RNR (R1 и R2); и каталитические ингибиторы, которые инактивируют субъединицу R1 и/или субъединицу R2. [21]
Класс I RNR может быть ингибирован пептидами, похожими на C-конец RNR2. Эти пептиды могут конкурировать с RNR2 за связывание с RNR1, и в результате RNR1 не образует ферментативно активный комплекс с RNR2. [29] [30] Хотя C-конец белков RNR2 отличается у разных видов, RNR2 может взаимодействовать с RNR1 у разных видов. [31] Когда C-конец мышиного RNR2 был заменен на остатки аминокислот C-конца RNR2 E. coli (7 или 33), химерная субъединица RNR2 все еще связывается с субъединицами мышиного RNR1. Однако у них отсутствует ферментативная активность, вероятно, из-за устранения остатков, участвующих в переносе электрона свободного радикала от RNR2 к субъединице RNR1. [30]
Малые пептиды могут специфически ингибировать связывание субъединиц RNR2 с RNR1, когда они имеют значительное сходство с нормальным С-концом RNR2. [32] Это ингибирование связывания RNR2 с RNR1 было успешно протестировано на RNR вируса простого герпеса (HSV). Когда олигомер из 7 аминокислот (GAVVNDL), укороченный с С-конца субъединицы RNR2, использовался в конкурентных анализах, он предотвращал образование нормального RNR2 ферментативно активного комплекса с RNR1. [33] Другие ингибиторы малых пептидов, подобные С-концу RNR2, также успешно использовались для ингибирования ферментативной активности RNR HSV и, таким образом, репликации HSV. [34] В мышиных моделях стромального кератита и неоваскуляризации роговицы ( глазное заболевание HSV ) сообщалось, что небольшой аналог C-конца RNR2 BILD 1263 ингибирует RNR и эффективен в профилактике этих заболеваний. [35] В некоторых случаях, хотя лечение небольшими аналогами C-конца может не остановить распространение заболевания, они все равно могут помочь в заживлении. Сообщалось, что при резистентном к ацикловиру HSV (PAAr5) небольшой пептидный ингибитор BILD 1633 в 5–10 раз более эффективен, чем BILD 1263, против кожной инфекции PAAr5. [36] Комбинированный терапевтический подход (BILD 1633 и ацикловир) более эффективен для заживления местных поражений у мышей. Эти данные свидетельствуют о том, что небольшие пептидные ингибиторы, которые конкурируют с RNR2 за связывание с RNR1, полезны для предотвращения распространения HSV.
Галлий ингибирует RNR2, заменяя Fe 3+ в активном центре. Мальтолат галлия — это перорально биодоступная форма галлия, которая использует эту ингибирующую активность для лечения рака, инфекций и других заболеваний. [37]
Препараты гидроксимочевина [38] и мотексафин гадолиний препятствуют действию этого фермента. [39]