stringtranslate.com

Секвенирование третьего поколения

Секвенирование третьего поколения (также известное как секвенирование длинного чтения ) — это класс методов секвенирования ДНК , которые производят более длинные чтения последовательностей , которые активно разрабатываются с 2008 года. [1]

Технологии секвенирования третьего поколения способны производить значительно более длинные считывания, чем секвенирование второго поколения , также известное как секвенирование следующего поколения. [1] Такое преимущество имеет решающее значение как для науки о геноме, так и для изучения биологии в целом. Однако данные секвенирования третьего поколения имеют гораздо более высокий уровень ошибок, чем предыдущие технологии, что может усложнить последующую сборку генома и анализ полученных данных. [2] Эти технологии находятся в стадии активного развития, и ожидается, что будут улучшены показатели высокого уровня ошибок. Было обнаружено, что для приложений, которые более терпимы к частоте ошибок, таких как вызов структурных вариантов, секвенирование третьего поколения превосходит существующие методы даже при низкой глубине покрытия секвенирования. [3]

Современные технологии

Технологии секвенирования с подходом, отличным от платформ второго поколения, впервые были описаны как «третье поколение» в 2008–2009 годах. [4]

В настоящее время в центре разработки технологии секвенирования третьего поколения находится несколько компаний, а именно: Pacific Biosciences , Oxford Nanopore Technology , Quantapore (Калифорния, США) и Stratos (WA-США). Эти компании используют принципиально разные подходы к секвенированию отдельных молекул ДНК.

PacBio разработала платформу секвенирования отдельных молекул в реальном времени (SMRT) , основанную на свойствах нулевой моды волноводов . Сигналы представлены в виде флуоресцентного излучения света от каждого нуклеотида, включенного ДНК-полимеразой, связанной со дном лунки zL.

Технология Oxford Nanopore предполагает пропускание молекулы ДНК через наноразмерную пористую структуру и последующее измерение изменений электрического поля, окружающего пору; в то время как Quantapore имеет другой запатентованный подход к нанопорам. Stratos Genomics разделяет основания ДНК полимерными вставками, « Xpandomers », чтобы обойти проблему «сигнал-шум» при считывании оцДНК нанопор.

Также следует отметить флуоресцентный подход Helicos к одной молекуле, но осенью 2015 года компания объявила о банкротстве .

Преимущества

Длительное чтение

По сравнению с технологиями секвенирования текущего поколения, секвенирование третьего поколения имеет очевидное преимущество, заключающееся в получении гораздо более длинных считываний. Ожидается, что эта большая длина чтения облегчит многочисленные вычислительные проблемы, связанные со сборкой генома, реконструкцией транскриптов и метагеномикой, а также другими важными областями современной биологии и медицины. [1]

Хорошо известно, что геномы эукариот, в том числе приматов и человека, сложны и содержат большое количество длинных повторяющихся участков. Короткие чтения в результате секвенирования второго поколения должны прибегать к аппроксимативным стратегиям, чтобы сделать вывод о последовательностях на больших расстояниях для сборки и вызова генетических вариантов. Чтение концов пары было использовано секвенированием второго поколения для борьбы с этими ограничениями. Однако точные длины фрагментов парных концов часто неизвестны и их также необходимо аппроксимировать. Делая возможными длинные считывания, технологии секвенирования третьего поколения имеют явные преимущества.

Эпигенетика

Эпигенетические маркеры — это стабильные и потенциально наследуемые модификации молекулы ДНК, отсутствующие в ее последовательности. Примером является метилирование ДНК по сайтам CpG, которое, как было обнаружено, влияет на экспрессию генов. Модификации гистонов являются еще одним примером. Современное поколение технологий секвенирования основано на лабораторных методах, таких как ChIP-секвенирование, для обнаружения эпигенетических маркеров. Эти методы включают маркировку цепи ДНК, разрыв и фильтрацию фрагментов, содержащих маркеры, с последующим секвенированием. Секвенирование третьего поколения может обеспечить прямое обнаружение этих маркеров благодаря их отличительному сигналу от других четырех нуклеотидных оснований. [5]

Мобильность и скорость

Портативный генный секвенатор MinION, Oxford Nanopore Technologies

Другие важные преимущества технологий секвенирования третьего поколения включают портативность и скорость секвенирования. [6] Поскольку по сравнению с секвенированием второго поколения требуется минимальная предварительная обработка образцов, можно разработать оборудование меньшего размера. Компания Oxford Nanopore Technology недавно выпустила в продажу секвенатор MinION. Этот секвенатор размером примерно с обычный USB-накопитель, и его можно легко использовать, подключив к ноутбуку. Кроме того, поскольку процесс секвенирования не распараллелен по областям генома, данные можно собирать и анализировать в режиме реального времени. Эти преимущества секвенирования третьего поколения могут хорошо подойти в условиях больниц, где требуется быстрый сбор и анализ данных на месте.

Проблемы

По состоянию на 2008 год секвенирование третьего поколения столкнулось с серьезными проблемами, главным образом связанными с точной идентификацией нуклеотидных оснований; частота ошибок все еще была намного выше по сравнению с секвенированием второго поколения. [2] Обычно это происходит из-за нестабильности задействованного молекулярного механизма. Например, в технологии одномолекулярного секвенирования PacBio в реальном времени молекула ДНК-полимеразы по мере выполнения процесса секвенирования становится все более поврежденной. [2] Кроме того, поскольку процесс происходит быстро, сигналы, исходящие от отдельных баз, могут быть размыты сигналами от соседних баз. Это создает новую вычислительную задачу для расшифровки сигналов и, следовательно, определения последовательности. Например, с некоторым успехом для этой цели использовались такие методы, как скрытые марковские модели . [5]

В среднем разные особи человеческой популяции имеют около 99,9% общих генов. Другими словами, примерно только одно из тысячи оснований будет различаться между любыми двумя людьми. Высокий уровень ошибок, связанный с секвенированием третьего поколения, неизбежно создает проблемы для характеристики индивидуальных различий, существующих между представителями одного и того же вида. [ нужна цитата ]

Сборка генома

Сборка генома — это реконструкция последовательностей ДНК целого генома. Обычно это делается с помощью двух принципиально разных подходов.

Справочное выравнивание

Когда доступен эталонный геном, как в случае с человеком, новые секвенированные чтения можно просто сопоставить с эталонным геномом, чтобы охарактеризовать его свойства. Такая сборка на основе эталонов выполняется быстро и легко, но имеет тот недостаток, что она «скрывает» новые последовательности и варианты с большим числом копий. Кроме того, для большинства организмов эталонные геномы еще не существуют.

Сборка заново

Сборка de novo — это альтернативный подход к сборке генома для выравнивания ссылок. Это относится к реконструкции целых последовательностей генома полностью на основе считывания необработанных последовательностей. Этот метод будет выбран, когда нет эталонного генома, когда вид данного организма неизвестен, как в метагеномике , или когда существуют представляющие интерес генетические варианты, которые не могут быть обнаружены путем выравнивания эталонного генома.

Учитывая короткие чтения, создаваемые нынешним поколением технологий секвенирования, сборка de novo представляет собой серьезную вычислительную проблему. Обычно для этого используют итеративный процесс поиска и соединения считываний последовательностей с разумным перекрытием. Для решения этой проблемы были использованы различные вычислительные и статистические методы, такие как графы де Брюйна и консенсусные графы перекрывающейся компоновки. Тем не менее, из-за высокой повторяемости геномов эукариот точная и полная реконструкция последовательностей генома при сборке de novo остается сложной задачей. Считывание концов пары рассматривается как возможное решение, хотя точная длина фрагментов часто неизвестна и должна быть приблизительно оценена. [7]

Гибридная сборка – использование считываний с платформ секвенирования 3-го поколения с короткими считываниями с платформ 2-го поколения – может использоваться для разрешения неоднозначностей, существующих в геномах, ранее собранных с использованием секвенирования второго поколения. Короткие чтения второго поколения также использовались для исправления ошибок, существующих при длинных чтениях третьего поколения.

Гибридная сборка

Большая длина считывания, обеспечиваемая секвенированием третьего поколения, может облегчить многие проблемы, с которыми в настоящее время сталкиваются сборки генома de novo. Например, если всю повторяющуюся область можно однозначно секвенировать за одно чтение, никаких вычислительных выводов не потребуется. Вычислительные методы были предложены для решения проблемы высокого уровня ошибок. Например, в одном исследовании было продемонстрировано, что сборка микробного генома de novo с использованием только секвенирования PacBio превосходит сборку секвенирования второго поколения. [8]

Секвенирование третьего поколения также можно использовать в сочетании с секвенированием второго поколения. Этот подход часто называют гибридным секвенированием. Например, длинные чтения в результате секвенирования третьего поколения могут использоваться для разрешения неоднозначностей, существующих в геномах, ранее собранных с использованием секвенирования второго поколения. С другой стороны, короткие чтения второго поколения использовались для исправления ошибок, существующих в длинных чтениях третьего поколения. В целом было показано, что этот гибридный подход значительно улучшает сборки генома de novo. [9]

Эпигенетические маркеры

Метилирование ДНК (DNAm) – ковалентная модификация ДНК в сайтах CpG, приводящая к присоединению метильных групп – является наиболее изученным компонентом эпигенетического механизма. Модификации ДНК и результирующая экспрессия генов могут варьироваться в зависимости от типа клеток, временное развитие, в зависимости от генетического происхождения, может меняться из-за стимулов окружающей среды и передается по наследству. После открытия DNAm исследователи также обнаружили его связь с такими заболеваниями, как рак и аутизм . [10] В контексте этиологии этого заболевания ДНКm является важным направлением дальнейших исследований.

Преимущества

В настоящее время наиболее распространенные методы исследования состояния метилирования требуют анализа , который фрагментирует ДНК перед стандартным секвенированием второго поколения на платформе Illumina . В результате короткой длины чтения информация о более длинных паттернах метилирования теряется. [5] Технологии секвенирования третьего поколения предлагают возможность секвенирования отдельных молекул в режиме реального времени с более длинными прочтениями и обнаружения модификации ДНК без вышеупомянутого анализа. [11]

Технология PacBio SMRT и Oxford Nanopore могут использовать неизмененную ДНК для обнаружения метилирования.

MinION компании Oxford Nanopore Technologies использовался для обнаружения ДНКm. Когда каждая нить ДНК проходит через пору, она производит электрические сигналы, которые, как было обнаружено, чувствительны к эпигенетическим изменениям в нуклеотидах, а скрытая модель Маркова (HMM) использовалась для анализа данных MinION для обнаружения ДНК 5-метилцитозина (5mC). модификация. [5] Модель была обучена с использованием синтетически метилированной ДНК E. coli , а полученные сигналы измерены с помощью технологии нанопор. Затем обученную модель использовали для обнаружения 5mC в геномных считываниях MinION из линии клеток человека, которая уже имела эталонный метилом. Классификатор имеет точность 82 % на одноэлементных сайтах, выбранных случайным образом, и эта точность возрастает до 95 % при применении более строгих пороговых значений. [5]

Другие методы направлены на различные типы модификаций ДНК с использованием платформы MinION. Штойбер и др. исследовали 4-метилцитозин (4mC) и 6-метиладенин (6mA), а также 5mC, а также создали программное обеспечение для прямой визуализации необработанных данных MinION удобным для человека способом. [12] Здесь они обнаружили, что в E. coli , которая имеет известный метилом , окна событий длиной в 5 пар оснований могут использоваться для разделения и статистического анализа необработанных электрических сигналов MinION. Простой U-тест Манна-Уитни позволяет обнаружить модифицированные части последовательности E. coli , а также разделить эти модификации на участки 4mC, 6mA или 5mC. [12]

Вполне вероятно, что в будущем необработанные данные MinION будут использоваться для обнаружения множества различных эпигенетических меток в ДНК.

Секвенирование PacBio также использовалось для обнаружения метилирования ДНК. В этой платформе ширина импульса – ширина импульса флуоресцентного света – соответствует определенной базе. В 2010 г. было показано, что расстояние между импульсами в контрольных и метилированных образцах различно, и для каждого типа метилирования существует «характерная» ширина импульса. [11] В 2012 году с помощью платформы PacBio были охарактеризованы сайты связывания ДНК- метилтрансфераз . [13] Обнаружение N6-метилирования у C Elegans было показано в 2015 году. [14] Метилирование ДНК по N6 -аденину с использованием платформы PacBio в эмбриональных стволовых клетках мыши было показано в 2016 году. [15]

Другие формы модификаций ДНК – от тяжелых металлов, окисления или повреждения ультрафиолетом – также являются возможными направлениями исследований с использованием секвенирования третьего поколения Oxford Nanopore и PacBio.

Недостатки

Обработка необработанных данных, такая как нормализация к медианному сигналу, требовалась для необработанных данных MinION, что снижало возможности технологии в режиме реального времени. [12] Постоянство электрических сигналов по-прежнему остается проблемой, что затрудняет точное определение нуклеотида. MinION имеет низкую пропускную способность; поскольку трудно получить множественные перекрывающиеся чтения, это дополнительно приводит к проблемам с точностью обнаружения последующих модификаций ДНК. И скрытая модель Маркова, и статистические методы, используемые с необработанными данными MinION, требуют повторных наблюдений за модификациями ДНК для обнаружения, а это означает, что отдельные модифицированные нуклеотиды должны постоянно присутствовать во многих копиях генома, например, во многих клетках или плазмидах в образце.

Для платформы PacBio потребности в покрытии также могут различаться в зависимости от того, какое метилирование вы ожидаете обнаружить. По состоянию на март 2017 года другие эпигенетические факторы, такие как модификации гистонов, не были обнаружены с помощью технологий третьего поколения. Более длинные паттерны метилирования часто теряются, поскольку еще необходимо собрать более мелкие контиги.

Транскриптомика

Транскриптомика — это исследование транскриптома , обычно путем характеристики относительного содержания молекул информационной РНК в исследуемой ткани. Согласно центральной догме молекулярной биологии , генетическая информация передается от двухцепочечных молекул ДНК к одноцепочечным молекулам мРНК, где они могут быть легко транслированы в функциональные белковые молекулы. Изучая транскриптом, можно получить ценную информацию о регуляции экспрессии генов.

Хотя уровни экспрессии могут быть более или менее точно отображены с помощью секвенирования второго поколения (мы можем предположить, что фактическое содержание популяции транскриптов отбирается случайным образом), информация на уровне транскриптов по-прежнему остается важной проблемой. [16] Как следствие, роль альтернативного сплайсинга в молекулярной биологии остается в значительной степени неуловимой. Технологии секвенирования третьего поколения имеют многообещающие перспективы в решении этой проблемы, позволяя секвенировать молекулы мРНК на всю их длину.

Альтернативный сплайсинг

Альтернативный сплайсинг (АС) — это процесс, посредством которого один ген может давать начало множеству различных транскриптов мРНК и, следовательно, различным трансляциям белков. [17] Некоторые данные свидетельствуют о том, что АС является повсеместным явлением и может играть ключевую роль в определении фенотипов организмов, особенно у сложных эукариот; все эукариоты содержат гены, состоящие из интронов, которые могут подвергаться АС. В частности, было подсчитано, что АС встречается в 95% всех мультиэкзонных генов человека. [18] AS обладает неоспоримым потенциалом влиять на множество биологических процессов. Развитие знаний в этой области имеет решающее значение для изучения биологии в целом.

Реконструкция транскрипта

Нынешнее поколение технологий секвенирования производит только короткие чтения, что накладывает огромные ограничения на способность обнаруживать отдельные транскрипты; короткие чтения должны быть преобразованы в исходные транскрипты, которые могли бы привести к результирующим наблюдениям за чтением. [19] Эта задача еще больше усложняется из-за сильно варьирующихся уровней экспрессии транскриптов и, следовательно, вариабельного охвата чтения по последовательности гена. [19] Кроме того, экзоны могут быть общими для отдельных транскриптов, что делает однозначные выводы практически невозможными. [17] Существующие вычислительные методы делают выводы на основе накопления коротких чтений в различных местах последовательности, часто делая упрощающие предположения. [19] Запонки придерживаются экономного подхода, стремясь объяснить все чтения с помощью наименьшего количества расшифровок. [20] С другой стороны, StringTie пытается одновременно оценить количество транскриптов во время сборки прочтений. [19] Эти методы, хотя и разумны, не всегда могут идентифицировать настоящие стенограммы.

В исследовании, опубликованном в 2008 году, было рассмотрено 25 различных существующих протоколов реконструкции транскриптов. [16] Данные свидетельствуют о том, что существующие методы, как правило, слабы в сборке транскриптов, хотя способность обнаруживать отдельные экзоны относительно не нарушена. [16] По оценкам, средняя чувствительность обнаружения экзонов по 25 протоколам для генов Caenorhabditis elegans составляет 80%. [16] Для сравнения, чувствительность идентификации транскриптов снижается до 65%. Исследование показало, что для человека чувствительность обнаружения экзонов составляет в среднем 69%, а чувствительность обнаружения транскриптов — всего лишь 33%. [16] Другими словами, для человека существующие методы способны идентифицировать менее половины всех существующих транскриптов.

Технологии секвенирования третьего поколения продемонстрировали многообещающие перспективы в решении проблемы обнаружения транскриптов, а также оценки содержания мРНК на уровне транскриптов. Хотя уровень ошибок остается высоким, технологии секвенирования третьего поколения способны обеспечить гораздо большую длину считывания. [21] Компания Pacific Bioscience представила платформу iso-seq, предлагающую секвенировать молекулы мРНК на всю их длину. [21] Ожидается, что Oxford Nanopore предложит аналогичные технологии. Проблема с более высоким уровнем ошибок может быть решена дополнительными высококачественными короткими чтениями. Ранее этот подход был протестирован и сообщил, что он снижает частоту ошибок более чем в 3 раза. [22]

Метагеномика

Метагеномика — это анализ генетического материала, полученного непосредственно из образцов окружающей среды.

Преимущества

Основным преимуществом технологий секвенирования третьего поколения в метагеномике является скорость секвенирования по сравнению с методами второго поколения. Скорость секвенирования важна, например, в клинических условиях (т. е. идентификация патогена ), чтобы обеспечить эффективную диагностику и своевременные клинические действия.

MinION компании Oxford Nanopore использовался в 2015 году для метагеномного обнаружения патогенов в режиме реального времени в сложных клинических образцах с высоким фоном. Первое считывание вируса Эбола (EBOV) было секвенировано через 44 секунды после сбора данных. [23] Было единообразное сопоставление прочтений с геномом; по крайней мере одно чтение соответствует> 88% генома. Относительно длинные чтения позволили секвенировать почти полный вирусный геном с высокой точностью (идентичность 97–99%) непосредственно из первичного клинического образца. [23]

Общим филогенетическим маркером для изучения разнообразия микробных сообществ является ген 16S рибосомальной РНК . Платформа SMRT MinION и PacBio использовалась для секвенирования этого гена. [24] [25] В этом контексте частота ошибок PacBio была сопоставима с частотой ошибок при более коротких считываниях с платформ секвенирования 454 и Illumina MiSeq. [ нужна цитата ]

Недостатки

Высокая частота ошибок MinION (~ 10-40%) не позволяла идентифицировать маркеры устойчивости к противомикробным препаратам , для которых необходимо разрешение одного нуклеотида. По этой же причине не были идентифицированы эукариотические возбудители. [23] Также вызывает беспокойство легкость переноса загрязнения при повторном использовании одной и той же проточной кюветы (стандартные протоколы промывки не работают). Уникальные штрих-коды могут обеспечить большее мультиплексирование. Кроме того, провести точную идентификацию видов бактерий , грибов и паразитов очень сложно, поскольку они имеют большую часть генома, а некоторые различаются только на <5%.

Стоимость секвенирования на одно основание по-прежнему значительно выше, чем у MiSeq. Однако перспектива дополнения справочных баз данных полноразмерными последовательностями организмов ниже предела обнаружения подхода Сэнгера ; [24] это могло бы значительно помочь в идентификации организмов в метагеномике.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ abc Блейдорн, Кристоф (2 января 2016 г.). «Секвенирование третьего поколения: технология и ее потенциальное влияние на исследования эволюционного биоразнообразия». Систематика и биоразнообразие . 14 (1): 1–8. Бибкод : 2016SyBio..14....1B. дои : 10.1080/14772000.2015.1099575. ISSN  1477-2000. S2CID  85991118.
  2. ^ abc Гупта, Пушпендра К. (1 ноября 2008 г.). «Технологии секвенирования одномолекулярной ДНК для будущих исследований в области геномики». Тенденции в биотехнологии . 26 (11): 602–611. doi :10.1016/j.tibtech.2008.07.003. ПМИД  18722683.
  3. ^ Тэм, Ченг Юн (3 марта 2020 г.). «NanoVar: точная характеристика вариантов структуры генома пациентов с использованием секвенирования нанопор малой глубины». Геномная биология . 21 (Номер статьи: 56): 56. doi : 10.1186/s13059-020-01968-7 . ПМК 7055087 . ПМИД  32127024. 
  4. ^ Проверьте Хайден, Эрика (6 февраля 2009 г.). «Секвенирование генома: третье поколение». Новости природы . 457 (7231): 768–769. дои : 10.1038/news.2009.86 . ПМИД  19212365.
  5. ^ abcde Симпсон, Джаред Т.; Уоркман, Рэйчел; Зузарте, Филип К.; Дэвид, Матей; Дурси, Льюис Джонатан; Тимп, Уинстон (4 апреля 2016 г.). «Обнаружение метилирования ДНК с использованием секвенатора MinION Oxford Nanopore Technologies». bioRxiv 10.1101/047142 . 
  6. ^ Шадт, Э.Э.; Тернер, С.; Касарскис, А. (15 октября 2010 г.). «Окно в секвенирование третьего поколения». Молекулярная генетика человека . 19 (С2): Р227–Р240. дои : 10.1093/hmg/ddq416 . ISSN  0964-6906. ПМИД  20858600.
  7. ^ Ли, Жуйцян; Чжу, Хунмэй; Жуан, Цзюэ; Цянь, Вубин; Фан, Сяодун; Ши, Чжунбинь; Ли, Инжуй; Ли, Шэнтин; Шан, Гао (01 февраля 2010 г.). «Сборка геномов человека de novo с массовым параллельным секвенированием короткого чтения». Геномные исследования . 20 (2): 265–272. дои : 10.1101/гр.097261.109. ISSN  1088-9051. ПМЦ 2813482 . ПМИД  20019144. 
  8. ^ Чин, Чэнь-Шань; Александр, Дэвид Х.; Маркс, Патрик; Кламмер, Аарон А.; Дрейк, Джеймс; Хайнер, Шерил; Клам, Алисия; Коупленд, Алекс; Хаддлстон, Джон (01 июня 2013 г.). «Негибридные готовые сборки микробного генома на основе давно считанных данных секвенирования SMRT». Природные методы . 10 (6): 563–569. дои : 10.1038/nmeth.2474. ISSN  1548-7091. PMID  23644548. S2CID  205421576.
  9. ^ Гудвин, Сара; Гуртовски, Джеймс; Эте-Сэйерс, Скотт; Дешпанде, Панчаджанья; Шац, Майкл С.; МакКомби, В. Ричард (1 ноября 2015 г.). «Секвенирование Оксфордского нанопора, гибридная коррекция ошибок и сборка эукариотического генома de novo». Геномные исследования . 25 (11): 1750–1756. дои : 10.1101/гр.191395.115. ISSN  1088-9051. ПМЦ 4617970 . ПМИД  26447147. 
  10. ^ Фрейзер, Хантер Б.; Лам, Люсия Л.; Нойманн, Сара М.; Кобор, Майкл С. (9 февраля 2012 г.). «Популяционная специфичность метилирования ДНК человека». Геномная биология . 13 (2): С8. дои : 10.1186/gb-2012-13-2-r8 . ISSN  1474-760X. ПМЦ 3334571 . ПМИД  22322129. 
  11. ^ аб Флюсберг, Бенджамин А.; Вебстер, Дейл Р.; Ли, Джессика Х.; Трэверс, Кевин Дж.; Оливарес, Эрик С.; Кларк, Тайсон А.; Корлах, Йонас; Тернер, Стивен В. (01 июня 2010 г.). «Прямое обнаружение метилирования ДНК во время секвенирования одиночных молекул в реальном времени». Природные методы . 7 (6): 461–465. дои : 10.1038/nmeth.1459. ПМЦ 2879396 . ПМИД  20453866. 
  12. ^ abc Stoiber, Маркус Х.; Быстрее, Джошуа; Иган, Роб; Ли, Джи Ын; Селникер, Сьюзен Э.; Нили, Роберт; Ломан, Николас; Пеннаккио, Лен; Браун, Джеймс Б. (15 декабря 2016 г.). «Идентификация de novo модификаций ДНК, обеспечиваемая геномной обработкой сигналов нанопор». bioRxiv 10.1101/094672 . 
  13. ^ Кларк, штат Калифорния; Мюррей, Айова; Морган, доктор медицинских наук; Кислюк, АО; Спиттл, Кентукки; Бойтано, М.; Фоменков А.; Робертс, Р.Дж.; Корлах, Дж. (01 февраля 2012 г.). «Характеристика специфичности ДНК-метилтрансферазы с использованием одномолекулярного секвенирования ДНК в реальном времени». Исследования нуклеиновых кислот . 40 (4): е29. дои : 10.1093/nar/gkr1146. ISSN  0305-1048. ПМК 3287169 . ПМИД  22156058. 
  14. ^ Грир, Эрик Либерман; Бланко, Марио Андрес; Гу, Лей; Сендинц, Эрдем; Лю, Цзяньчжао; Аристисабаль-Корралес, Давид; Сюй, Чи-Хун; Аравинд, Л.; Он, Чуан (2015). «Метилирование ДНК N6-аденина у C. elegans». Клетка . 161 (4): 868–878. дои : 10.1016/j.cell.2015.04.005. ПМЦ 4427530 . ПМИД  25936839. 
  15. ^ Ву, Тао П.; Ван, Тао; Ситин, Мэтью Г.; Лай, Юнцюань; Чжу, Шицзя; Линь, Кайсюань; Лю, Ифэй; Байрам, Стефани Д.; Макинтош, Сэмюэл Г. (21 апреля 2016 г.). «Метилирование ДНК N6-аденина в эмбриональных стволовых клетках млекопитающих». Природа . 532 (7599): 329–333. Бибкод : 2016Natur.532..329W. дои : 10.1038/nature17640. ISSN  0028-0836. ПМЦ 4977844 . ПМИД  27027282. 
  16. ^ abcde Steijger, Тамара; Абриль, Хосеп Ф.; Энгстрём, Пар Г.; Кокочинский, Феликс; Консорциум RGASP; Хаббард, Тим Дж.; Гиго, Родерик; Харроу, Дженнифер; Бертоне, Пол (1 декабря 2013 г.). «Оценка методов реконструкции транскриптов для секвенирования РНК». Природные методы . 10 (12): 1177–1184. дои : 10.1038/nmeth.2714. ISSN  1548-7091. ПМЦ 3851240 . ПМИД  24185837. 
  17. ^ аб Грейвли, Брентон Р. (2001). «Альтернативный сплайсинг: увеличение разнообразия в протеомном мире». Тенденции в генетике . 17 (2): 100–107. дои : 10.1016/s0168-9525(00)02176-4. ПМИД  11173120.
  18. ^ Пан, Цюнь; Шай, Офер; Ли, Лео Дж.; Фрей, Брендан Дж.; Бленкоу, Бенджамин Дж. (1 декабря 2008 г.). «Глубокое исследование сложности альтернативного сплайсинга транскриптома человека с помощью высокопроизводительного секвенирования». Природная генетика . 40 (12): 1413–1415. дои : 10.1038/ng.259. ISSN  1061-4036. PMID  18978789. S2CID  9228930.
  19. ^ abcd Пертеа, Михаэла; Пертеа, Гео М.; Антонеску, Корина М.; Чанг, Цунг-Ченг; Менделл, Джошуа Т.; Зальцберг, Стивен Л. (01 марта 2015 г.). «StringTie позволяет улучшить реконструкцию транскриптома на основе считываний RNA-seq». Природная биотехнология . 33 (3): 290–295. дои : 10.1038/nbt.3122. ISSN  1087-0156. ПМЦ 4643835 . ПМИД  25690850. 
  20. ^ Трапнелл, Коул; Уильямс, Брайан А.; Пертеа, Гео; Мортазави, Али; Кван, Гордон; ван Барен, Марийке Дж.; Зальцберг, Стивен Л.; Уолд, Барбара Дж.; Пахтер, Лиор (01 мая 2010 г.). «Сборка транскриптов и количественная оценка с помощью RNA-Seq выявляют неаннотированные транскрипты и переключение изоформ во время дифференцировки клеток». Природная биотехнология . 28 (5): 511–515. дои : 10.1038/nbt.1621. ISSN  1087-0156. ПМК 3146043 . ПМИД  20436464. 
  21. ^ аб Абдель-Гани, Салах Э.; Гамильтон, Майкл; Якоби, Дженнифер Л.; Нгам, Питер; Девитт, Николас; Шилки, Фэй; Бен-Гур, Аса; Редди, Аниредди СН (24 июня 2016 г.). «Обзор транскриптома сорго с использованием лонг-ридов одной молекулы». Природные коммуникации . 7 : 11706. Бибкод : 2016NatCo...711706A. doi : 10.1038/ncomms11706. ISSN  2041-1723. ПМК 4931028 . ПМИД  27339290. 
  22. ^ Ау, Кин Фай; Андервуд, Джейсон Г.; Ли, Лоуренс; Вонг, Винг Хун (04 октября 2012 г.). «Повышение точности длинного считывания PacBio за счет выравнивания короткого считывания». ПЛОС ОДИН . 7 (10): е46679. Бибкод : 2012PLoSO...746679A. дои : 10.1371/journal.pone.0046679 . ISSN  1932-6203. ПМК 3464235 . ПМИД  23056399. 
  23. ^ abc Гренингер, Александр Л .; Наккаче, Самия Н.; Федерман, шотландец; Ю, Гуйся; Мбала, Плацид; Брес, Ванесса; Страйк, Дуг; Букет, Джером; Сомасекар, Снеха (1 января 2015 г.). «Быстрая метагеномная идентификация вирусных патогенов в клинических образцах путем анализа секвенирования нанопор в реальном времени». Геномная медицина . 7:99 . doi : 10.1186/s13073-015-0220-9 . ISSN  1756-994Х. ПМЦ 4587849 . ПМИД  26416663. 
  24. ^ ab Schloss, Патрик Д.; Джениор, Мэтью Л.; Компурас, Чарльз К.; Уэсткотт, Сара Л.; Горец, Сара К. (1 января 2016 г.). «Секвенирование фрагментов гена 16S рРНК с использованием системы секвенирования ДНК PacBio SMRT». ПерДж . 4 : е1869. дои : 10.7717/peerj.1869 . ПМЦ 4824876 . ПМИД  27069806. 
  25. ^ Бенитес-Паес, Альфонсо; Портун, Кевин Дж.; Санс, Иоланда (01 января 2016 г.). «Разрешение на видовом уровне ампликонов гена 16S рРНК, секвенированных с помощью портативного секвенатора нанопор MinION ™». ГигаСайенс . 5 : 4. дои : 10.1186/s13742-016-0111-z . ISSN  2047-217X. ПМЦ 4730766 . ПМИД  26823973. 

Внешние ссылки