Флуоресцентная метка

Септины S. cerevisiae , выявленные с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием флуоресцентной маркировки

В молекулярной биологии и биотехнологии флуоресцентная метка , также известная как флуоресцентная метка или флуоресцентный зонд , представляет собой молекулу , которая химически присоединяется для помощи в обнаружении биомолекулы, такой как белок, антитело или аминокислота. Как правило, флуоресцентное мечение или маркировка использует реактивное производное флуоресцентной молекулы, известной как флуорофор . Флуорофор селективно связывается с определенной областью или функциональной группой на целевой молекуле и может быть присоединен химически или биологически. ^[1] Широко используются различные методы маркировки, такие как ферментативное мечение, мечение белков и генетическое мечение. Бромистый этидий , флуоресцеин и зеленый флуоресцентный белок являются распространенными метками. Наиболее часто мечеными молекулами являются антитела, белки, аминокислоты и пептиды, которые затем используются в качестве специфических зондов для обнаружения определенной цели. ^[2]

История

Стоукс Джордж Г.

Осаму Шимомура-пресс-конференция 06 декабря 2008-1

Разработка методов обнаружения и идентификации биомолекул была мотивирована возможностью улучшить изучение молекулярной структуры и взаимодействий. До появления флуоресцентной маркировки радиоизотопы использовались для обнаружения и идентификации молекулярных соединений. С тех пор были разработаны более безопасные методы, которые включают использование флуоресцентных красителей или флуоресцентных белков в качестве меток или зондов в качестве средств для маркировки и идентификации биомолекул. ^[3] Хотя флуоресцентная маркировка в этом отношении стала использоваться только недавно, открытие флуоресценции произошло уже гораздо раньше.

Сэр Джордж Стокс разработал закон флуоресценции Стокса в 1852 году, который гласит, что длина волны флуоресцентного излучения больше, чем длина волны возбуждающего излучения. Затем Ричард Мейер в 1897 году назвал флуорофором химическую группу, связанную с флуоресценцией. С тех пор флуоресцеин был создан как флуоресцентный краситель Адольфом фон Байером в 1871 году, а метод окрашивания был разработан и использован с развитием флуоресцентной микроскопии в 1911 году. ^[4]

Этидий бромид и его варианты были разработаны в 1950-х годах, ^[4] а в 1994 году были введены флуоресцентные белки или FPs. ^[5] Зеленый флуоресцентный белок или GFP был открыт Осаму Шимомура в 1960-х годах и был разработан как молекула-трейсер Дугласом Прашером в 1987 году. ^[6] FPs привели к прорыву в визуализации живых клеток с возможностью выборочно маркировать генетические белковые регионы и наблюдать функции и механизмы белков. ^[5] За этот прорыв Шимомура был удостоен Нобелевской премии в 2008 году. ^[7]

Были разработаны новые методы отслеживания биомолекул, включая использование колориметрических биосенсоров, фотохромных соединений, биоматериалов и электрохимических сенсоров. Флуоресцентная маркировка также является распространенным методом, в котором приложения расширились до ферментативной маркировки, химической маркировки, маркировки белков и генетической маркировки. ^[1]

Типы биосенсоров

Методы отслеживания биомолекул

В настоящее время существует несколько методов маркировки для отслеживания биомолекул. Некоторые из методов включают следующее.

Изотопные маркеры

Распространенные виды, для которых используются изотопные маркеры, включают белки. В этом случае аминокислоты со стабильными изотопами углерода, азота или водорода включаются в полипептидные последовательности. ^[8] Затем эти полипептиды подвергаются масс-спектрометрии . Благодаря точно определенным изменениям, которые эти изотопы вызывают в пептидах, с помощью графика спектрометрии можно определить, какие пептиды содержали изотопы. Таким образом, можно извлечь интересующий белок из нескольких других в группе. Изотопные соединения играют важную роль в качестве фотохромов, описанных ниже.

Колориметрические биосенсоры

Биосенсоры прикрепляются к интересующему веществу. Обычно это вещество не может поглощать свет, но с прикрепленным биосенсором свет может поглощаться и испускаться на спектрофотометре . [ ^9] Кроме того, флуоресцентные биосенсоры можно увидеть невооруженным глазом. Некоторые флуоресцентные биосенсоры также обладают способностью менять цвет в изменяющихся условиях (например, с синего на красный). Исследователь сможет осмотреть и получить данные об окружающей среде на основе того, какой цвет он или она может видеть визуально от гибридного вида биосенсор-молекула. ^​​[10]

Колориметрические анализы обычно используются для определения концентрации одного вида по отношению к другому. ^[9]

Фотохромные соединения

Фотохромные соединения обладают способностью переключаться между диапазоном или множеством цветов. Их способность отображать различные цвета заключается в том, как они поглощают свет. Различные изомерные проявления молекулы поглощают различные длины волн света, так что каждый изомерный вид может отображать другой цвет в зависимости от его поглощения. К ним относятся фотопереключаемые соединения, которые представляют собой белки, которые могут переключаться из нефлуоресцентного состояния в флуоресцентное при определенной среде. ^[11]

Наиболее распространенной органической молекулой, используемой в качестве фотохрома, является диарилетен . ^[12] Другие примеры фотопереключаемых белков включают PADRON-C, rs-FastLIME-s и bs-DRONPA-s, которые могут использоваться как в клетках растений, так и млекопитающих для наблюдения за перемещением клеток в различные среды. ^[11]

Биоматериалы

Флуоресцентные биоматериалы являются возможным способом использования внешних факторов для более наглядного наблюдения за путем. Метод включает флуоресцентную маркировку пептидных молекул, которые изменят естественный путь организма. Когда этот пептид вставляется в клетку организма, он может вызвать другую реакцию. Этот метод можно использовать, например, для лечения пациента, а затем наглядно увидеть результат лечения. ^[13]

Электрохимические датчики

Электрохимические датчики могут использоваться для безметкового зондирования биомолекул. Они обнаруживают изменения и измеряют ток между зондируемым металлическим электродом и электролитом, содержащим целевой аналит. Затем известный потенциал к электроду подается от тока обратной связи, и результирующий ток может быть измерен. Например, одна из методик, использующих электрохимическое зондирование, включает медленное повышение напряжения, заставляющее химические вещества на электроде окисляться или восстанавливаться. Строится график зависимости тока ячейки от напряжения, который в конечном итоге может идентифицировать количество химических веществ, потребляемых или производимых на электроде. ^[14] Флуоресцентные метки могут использоваться в сочетании с электрохимическими датчиками для простоты обнаружения в биологической системе.

Флуоресцентные этикетки

Эквореа Виктория

Структура GFP

Из различных методов маркировки биомолекул флуоресцентные метки имеют преимущество в том, что они очень чувствительны даже при низкой концентрации и не оказывают разрушительного воздействия на сворачивание и функцию целевой молекулы. ^[1]

Зеленый флуоресцентный белок — это встречающийся в природе флуоресцентный белок из медузы Aequorea victoria , который широко используется для маркировки интересующих белков. GFP испускает фотон в зеленой области светового спектра при возбуждении поглощением света. Хромофор состоит из окисленного трипептида -Ser^65-Tyr^66-Gly^67, расположенного внутри β-бочонка. GFP катализирует окисление и требует только молекулярного кислорода. GFP был модифицирован путем изменения длины волны поглощаемого света, чтобы включить другие цвета флуоресценции. YFP или желтый флуоресцентный белок , BFP или синий флуоресцентный белок и CFP или голубой флуоресцентный белок являются примерами вариантов GFP. Эти варианты производятся путем генной инженерии гена GFP. ^[15]

Синтетические флуоресцентные зонды также могут использоваться в качестве флуоресцентных меток. Преимущества этих меток включают меньший размер и большее разнообразие цветов. Их можно использовать для более селективной маркировки интересующих белков различными методами, включая химическую маркировку на основе распознавания, например, с использованием пептидных меток, хелатирующих металлы, и биологическую маркировку на основе распознавания с использованием ферментативных реакций. ^[16] Однако, несмотря на широкий спектр длин волн возбуждения и испускания, а также лучшую стабильность, синтетические зонды, как правило, токсичны для клетки и поэтому обычно не используются в исследованиях по визуализации клеток. ^[1]

Флуоресцентные метки могут быть гибридизированы с мРНК, чтобы помочь визуализировать взаимодействие и активность, например, локализацию мРНК. Антисмысловая цепь, помеченная флуоресцентным зондом, прикрепляется к одной цепи мРНК, и затем может быть просмотрена во время развития клетки, чтобы увидеть движение мРНК внутри клетки. ^[17]

Флуорогенные метки

Флуороген — это лиганд (флуорогенный лиганд), который сам по себе не является флуоресцентным, но становится флуоресцентным, когда он связывается со специфической структурой белка или РНК. ^[18]

Например, FAST — это вариант фотоактивного желтого белка , который был разработан для связывания химических имитаторов трипептидного хромофора GFP. ^[19] Аналогично, аптамер шпината — это сконструированная последовательность РНК, которая может связывать химические имитаторы хромофора GFP, тем самым придавая условную и обратимую флуоресценцию молекулам РНК, содержащим последовательность. ^[20]

Использование меток в флуоресцентной маркировке

В прямом тесте на флуоресцентные антитела антитела химически связываются с флуоресцентным красителем.

FISH-изображение бифидобактерий Cy3

FISH-анализ синдрома Джорджа

Флуоресцентная маркировка известна своей неразрушающей природой и высокой чувствительностью. Это сделало ее одним из наиболее широко используемых методов маркировки и отслеживания биомолекул. ^[1] В зависимости от природы мишени можно использовать несколько методов флуоресцентной маркировки.

Ферментативная маркировка

При ферментативном маркировании сначала формируется конструкция ДНК с использованием гена и ДНК флуоресцентного белка. ^[21] После транскрипции образуется гибрид РНК + флуоресцент. Интересующий объект прикрепляется к ферменту, который может распознавать эту гибридную ДНК. Обычно в качестве флуорофора используется флуоресцеин.

Химическая маркировка

Химическая маркировка или использование химических меток использует взаимодействие между небольшой молекулой и определенной генетической последовательностью аминокислот. ^[22] Химическая маркировка иногда используется как альтернатива GFP. Синтетические белки, которые функционируют как флуоресцентные зонды, меньше, чем GFP, и поэтому могут функционировать как зонды в более широком спектре ситуаций. Более того, они предлагают более широкий диапазон цветов и фотохимических свойств. ^[23] С недавними достижениями в области химической маркировки химические метки стали предпочтительнее флуоресцентных белков из-за архитектурных и размерных ограничений характерного β-ствола флуоресцентного белка. Изменения флуоресцентных белков могут привести к потере флуоресцентных свойств. ^[22]

Маркировка белков

Маркировка белков использует короткую метку, чтобы минимизировать нарушение фолдинга и функции белка. Переходные металлы используются для связывания определенных остатков в метках с сайт-специфичными мишенями, такими как N-концы, C-концы или внутренние сайты в белке. Примерами меток, используемых для маркировки белков, являются биарсенические метки, гистидиновые метки и метки FLAG. ^[1]

Генетическая маркировка

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) является примером метода генетической маркировки, который использует зонды, специфичные для хромосомных участков по всей длине хромосомы, также известного как окрашивание хромосом . Несколько флуоресцентных красителей, каждый из которых имеет различную длину волны возбуждения и испускания, связываются с зондом, который затем гибридизуется с хромосомами. Флуоресцентный микроскоп может обнаружить присутствующие красители и отправить их на компьютер, который может выявить кариотип клетки. Этот метод позволяет выявить такие аномалии, как делеции и дупликации. ^[24]

Визуализация клеток

Химические метки были адаптированы для технологий визуализации в большей степени, чем флуоресцентные белки, поскольку химические метки могут локализовать фотосенсибилизаторы ближе к целевым белкам. ^[25] Затем белки могут быть помечены и обнаружены с помощью визуализации, такой как микроскопия сверхвысокого разрешения , визуализация Ca ²⁺ , зондирование pH, обнаружение перекиси водорода, инактивация света с помощью хромофора и многофотонная световая микроскопия. Исследования визуализации in vivo на живых животных были впервые выполнены с использованием мономерного белка, полученного из бактериальной галоалкандегалогеназы, известной как Halo-tag. ^{[22] [26]} Halo-tag ковалентно связывается со своим лигандом и обеспечивает лучшую экспрессию растворимых белков. ^[26]

Преимущества

Хотя флуоресцентные красители могут не обладать такой же чувствительностью, как радиоактивные зонды, они способны в реальном времени показывать активность молекул в действии. ^[27] Более того, радиация и правильное обращение больше не являются проблемой.

С развитием флуоресцентного мечения флуоресцентная микроскопия позволила визуализировать определенные белки как на фиксированных, так и на живых изображениях клеток. Локализация определенных белков привела к важным концепциям в клеточной биологии, таким как функции отдельных групп белков в клеточных мембранах и органеллах. В визуализации живых клеток флуоресцентные метки позволяют отслеживать движения белков и их взаимодействия. ^[24]

Последние достижения в методах, включающих флуоресцентные метки, привели к визуализации мРНК и ее локализации в различных организмах. Визуализация РНК в живых клетках может быть достигнута путем введения синтезированной РНК, которая химически связана с флуоресцентной меткой, в живые клетки с помощью микроинъекции. Эта техника была использована, чтобы показать, как мРНК oskar в эмбрионе Drosophila локализуется в задней области ооцита . [ ^17]

Смотрите также

• Молекулярная маркировка велосиметрии
• Спектрофотометр для измерения нуклеиновых кислот
• Белковые теги

Примечания

1. Sahoo, Harekrushna (1 января 2012 г.). «Флуоресцентные методы маркировки биомолекул: ретроспективный снимок». RSC Advances . 2 (18): 7017–7029. Bibcode : 2012RSCAd...2.7017S. doi : 10.1039/C2RA20389H.
2. "Флуоресцентная маркировка биомолекул органическими зондами - Презентации - PharmaXChange.info". 29 января 2011 г.
3. Гвинн и Пейдж, Питер и Гай. «Тенденции лабораторных технологий: флуоресценция + маркировка». Science . Получено 10 марта 2013 г.
4. Kricka LJ, Fortina P (апрель 2009 г.). «Аналитическая родословная: «первые» в флуоресцентной маркировке нуклеозидов, нуклеотидов и нуклеиновых кислот». Клиническая химия . 55 (4): 670–83. doi : 10.1373/clinchem.2008.116152 . PMID  19233914.
5. Jing C, Cornish VW (сентябрь 2011 г.). «Химические метки для маркировки белков внутри живых клеток». Accounts of Chemical Research . 44 (9): 784–92. doi :10.1021/ar200099f. PMC 3232020. PMID  21879706 . 
6. «Зеленый флуоресцентный белок — история GFP — Осаму Шимомура».
7. Шимомура, Осаму. "Нобелевская премия по химии" . Получено 5 апреля 2013 г.
8. Чен X, Смит Л.М., Брэдбери Э.М. (март 2000 г.). «Метки масс-спектров с использованием стабильных изотопов в белках для точной и эффективной идентификации белков». Аналитическая химия . 72 (6): 1134–43. doi :10.1021/ac9911600. PMID  10740850.
9. "Колориметрические анализы" . Получено 3 апреля 2013 г.
10. Halevy, Revital; Sofiya Kolusheval; Robert EW Hancock; Raz Jelinek (2002). "Colorimetric Biosensor Vesicles for Biotechnological Applications" (PDF) . Материалы симпозиума Materials Research Society . 724. Биологические и биомиметические материалы — свойства для функции. Архивировано (PDF) из оригинала 14 октября 2013 г. . Получено 4 апреля 2013 г. .
11. Lummer M, Humpert F, Wiedenlübbert M, Sauer M, Schüttpelz M, Staiger D (сентябрь 2013 г.). «Новый набор обратимо фотопереключаемых флуоресцентных белков для использования в трансгенных растениях». Molecular Plant . 6 (5): 1518–30. doi : 10.1093/mp/sst040 . PMID  23434876.
12. Perrier A, Maurel F, Jacquemin D (август 2012 г.). «Мультифотохромизм одной молекулы с диарилетенами». Accounts of Chemical Research . 45 (8): 1173–82. doi :10.1021/ar200214k. PMID  22668009.
13. Zhang Y, Yang J (январь 2013 г.). «Стратегии проектирования флуоресцентных биоразлагаемых полимерных биоматериалов». Journal of Materials Chemistry B . 1 (2): 132–148. doi :10.1039/C2TB00071G. PMC 3660738 . PMID  23710326. 
14. "bioee.ee.columbia.edu" (PDF) . Архивировано из оригинала (PDF) 2012-12-20.
15. Кокс, Майкл; Нельсон, Дэвид Р.; Ленингер, Альберт Л. (2008). Принципы биохимии Ленингера . Сан-Франциско: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-7108-1.
16. Jung D, Min K, Jung J, Jang W, Kwon Y (май 2013 г.). «Подходы на основе химической биологии к флуоресцентной маркировке белков в живых клетках». Molecular BioSystems . 9 (5): 862–72. doi :10.1039/c2mb25422k. PMID  23318293.
17. Weil TT, Parton RM, Davis I (июль 2010 г.). «Делая сообщение ясным: визуализируя локализацию мРНК». Trends in Cell Biology . 20 (7): 380–90. doi :10.1016/j.tcb.2010.03.006. PMC 2902723. PMID  20444605 . 
18. Szent-Gyorgyi C, Schmidt BF, Schmidt BA, Creeger Y, Fisher GW, Zakel KL, Adler S, Fitzpatrick JA, Woolford CA, Yan Q, Vasilev KV, Berget PB, Bruchez MP, Jarvik JW, Waggoner A (февраль 2008 г.). «Активирующие флуороген одноцепочечные антитела для визуализации белков клеточной поверхности». Nature Biotechnology (реферат). 26 (2): 235–40. doi :10.1038/nbt1368. PMID  18157118. S2CID  21815631. Здесь мы сообщаем о разработке белковых репортеров, которые генерируют флуоресценцию из темных молекул (флуорогенов).
19. Plamont MA, Billon-Denis E, Maurin S, Gauron C, Pimenta FM, Specht CG, Shi J, Quérard J, Pan B, Rossignol J, Moncoq K, Morellet N, Volovitch M, Lescop E, Chen Y, Triller A, Vriz S, Le Saux T, Jullien L, Gautier A (январь 2016 г.). "Малая флуоресцентно-активирующая и абсорбционно-смещающая метка для настраиваемой визуализации белков in vivo". Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 113 (3): 497–502. Bibcode : 2016PNAS..113..497P. doi : 10.1073/pnas.1513094113 . PMC 4725535 . PMID  26711992. 
20. Paige JS, Wu KY, Jaffrey SR (июль 2011 г.). «РНК-имитаторы зеленого флуоресцентного белка». Science . 333 (6042): 642–6. Bibcode :2011Sci...333..642P. doi :10.1126/science.1207339. PMC 3314379 . PMID  21798953. 
21. Richter A, Schwager C, Hentze S, Ansorge W, Hentze MW, Muckenthaler M (сентябрь 2002 г.). «Сравнение методов маркировки флуоресцентной ДНК-меткой, используемых для анализа экспрессии с помощью ДНК-микрочипов» (PDF) . BioTechniques . 33 (3): 620–8, 630. doi : 10.2144/02333rr05 . PMID  12238772.
22. Wombacher R, Cornish VW (июнь 2011 г.). «Химические метки: применение в флуоресцентной визуализации живых клеток». Журнал биофотоники . 4 (6): 391–402. doi : 10.1002/jbio.201100018 . PMID  21567974.
23. Jung D, Min K, Jung J, Jang W, Kwon Y (май 2013 г.). «Подходы на основе химической биологии к флуоресцентной маркировке белков в живых клетках». Molecular BioSystems . 9 (5): 862–72. doi :10.1039/C2MB25422K. PMID  23318293.
24. Matthew P Scott; Lodish, Harvey F.; Arnold Berk; Kaiser, Chris; Monty Krieger; Anthony Bretscher; Hidde Ploegh; Angelika Amon (2012). Молекулярная клеточная биология . Сан-Франциско: WH Freeman. ISBN 978-1-4292-3413-9.
25. Эттингер, А. (2014). «Флуоресцентная визуализация живых клеток». Методы в клеточной биологии . 123 : 77–94. doi : 10.1016/B978-0-12-420138-5.00005-7. ISBN 9780124201385. PMC  4198327 . PMID  24974023.
26. N Peterson S, Kwon K (2012). «HaloTag: улучшение растворимой экспрессии и применения в функциональном анализе белков». Current Chemical Genomics . 6 (1): 8–17. doi :10.2174/1875397301206010008. PMC 3480702 . PMID  23115610. 
27. Прудников Д., Мирзабеков А. (ноябрь 1996 г.). «Химические методы флуоресцентного мечения ДНК и РНК». Nucleic Acids Research . 24 (22): 4535–42. doi :10.1093/nar/24.22.4535. PMC 146275. PMID  8948646 . 

Внешние ссылки