Фосфофруктокиназа-1 ( ФФК-1 ) — один из важнейших регуляторных ферментов ( EC 2.7.1.11) гликолиза . Это аллостерический фермент , состоящий из 4 субъединиц и контролируемый множеством активаторов и ингибиторов . ПФК-1 катализирует важную «совершенную» стадию гликолиза, превращение фруктозо-6-фосфата и АТФ во фруктозо-1,6-бисфосфат и АДФ . Гликолиз является основой дыхания, как анаэробного, так и аэробного. Поскольку фосфофруктокиназа (PFK) катализирует АТФ-зависимое фосфорилирование с превращением фруктозо-6-фосфата во фруктозо-1,6-бисфосфат и АДФ, это один из ключевых регуляторных этапов гликолиза. [1] ПФК способна регулировать гликолиз посредством аллостерического ингибирования, и таким образом клетка может увеличивать или уменьшать скорость гликолиза в ответ на энергетические потребности клетки. Например, высокое соотношение АТФ к АДФ будет ингибировать ПФК и гликолиз. Ключевое различие между регуляцией ПФК у эукариот и прокариот заключается в том, что у эукариот ПФК активируется фруктозо-2,6-бисфосфатом. Целью фруктозо-2,6-бисфосфата является преодоление ингибирования АТФ, что позволяет эукариотам иметь большую чувствительность к регуляции с помощью таких гормонов, как глюкагон и инсулин. [2]
PFK1 млекопитающих представляет собой тетрамер массой 340 кДа [3] , состоящий из различных комбинаций трех типов субъединиц: мышечной (M), печени (L) и тромбоцитов (P). Состав тетрамера PFK1 различается в зависимости от типа ткани, в которой он присутствует. Например, зрелая мышца экспрессирует только изозим M , следовательно, мышечная PFK1 состоит исключительно из гомотетрамеров M4. Печень и почки экспрессируют преимущественно изоформу L. В эритроцитах субъединицы M и L случайным образом тетрамеризуются с образованием M4, L4 и трех гибридных форм фермента (ML3, M2L2, M3L). В результате кинетические и регуляторные свойства различных пулов изоферментов зависят от состава субъединиц. Тканеспецифичные изменения активности ПФК и содержания изоферментов в значительной степени способствуют различиям скоростей гликолитического и глюконеогенного действия, которые наблюдаются для разных тканей. [4]
PFK1 является аллостерическим ферментом и имеет структуру, аналогичную структуре гемоглобина, поскольку он представляет собой димер димера. [5] Одна половина каждого димера содержит сайт связывания АТФ, тогда как другая половина — сайт связывания субстрата (фруктозо-6-фосфат или (F6P)), а также отдельный аллостерический сайт связывания. [6]
Каждая субъединица тетрамера состоит из 319 аминокислот и состоит из двух доменов: один связывает субстрат АТФ, а другой связывает фруктозо-6-фосфат. Каждый домен представляет собой бета-цилиндр и имеет цилиндрический бета-лист, окруженный альфа-спиралями.
На противоположной стороне каждой субъединицы от каждого активного сайта находится аллостерический сайт, на границе раздела субъединиц в димере. ATP и AMP конкурируют за этот сайт. N-концевой домен играет каталитическую роль, связывая АТФ, а С-концевой — регуляторную роль [7].
PFK1 представляет собой аллостерический фермент, активность которого можно описать с помощью модели симметрии аллостеризма [8] , при которой происходит согласованный переход из ферментативно неактивного Т-состояния в активное R-состояние. F6P с высоким сродством связывается с ферментом в состоянии R, но не с ферментом в состоянии T. Для каждой молекулы F6P, которая связывается с PFK1, фермент постепенно переходит из состояния T в состояние R. Таким образом, график, отображающий активность PFK1 в зависимости от увеличения концентрации F6P, будет иметь форму сигмоидальной кривой, традиционно связанной с аллостерическими ферментами.
PFK1 принадлежит к семейству фосфотрансфераз и катализирует перенос γ-фосфата из АТФ во фруктозо-6-фосфат. Активный сайт PFK1 включает в себя сайты связывания ATP-Mg2+ и F6P. Некоторые предполагаемые остатки, участвующие в связывании субстрата в PFK1 E. coli , включают Asp127 и Arg171 . [9] У B. stearothermophilus PFK1 положительно заряженная боковая цепь остатка Arg162 образует солевой мостик с водородными связями с отрицательно заряженной фосфатной группой F6P, взаимодействие, которое стабилизирует состояние R относительно состояния T и частично отвечает за гомотропный эффект связывания F6P. В состоянии Т конформация фермента слегка смещается, так что пространство, ранее занимаемое Arg162, заменяется Glu161 . Эта замена позиций между соседними аминокислотными остатками ингибирует способность F6P связываться с ферментом.
Аллостерические активаторы, такие как АМФ и АДФ, связываются с аллостерическим сайтом, чтобы облегчить формирование состояния R, вызывая структурные изменения в ферменте. Аналогично, ингибиторы, такие как АТФ и ПЭП, связываются с одним и тем же аллостерическим сайтом и способствуют образованию Т-состояния, тем самым ингибируя активность фермента.
Гидроксильный кислород углерода 1 осуществляет нуклеофильную атаку на бета-фосфат АТФ. Эти электроны отодвигаются к ангидридному кислороду между бета- и гамма-фосфатами АТФ. [10] [11]
PFK1 является наиболее важным центром контроля гликолитического пути млекопитающих. Этот этап подлежит тщательному регулированию, поскольку он не только высоко экзергоничен в физиологических условиях , но и потому, что это обязательный этап – первая необратимая реакция, уникальная для гликолитического пути. Это приводит к точному контролю глюкозы и других моносахаридов, галактозы и фруктозы , идущих по гликолитическому пути. До реакции этого фермента глюкозо-6-фосфат потенциально может перемещаться по пентозофосфатному пути или превращаться в глюкозо-1-фосфат для гликогенеза .
PFK1 аллостерически ингибируется высокими уровнями АТФ , но AMP обращает ингибирующее действие АТФ. Следовательно, активность фермента увеличивается при снижении клеточного соотношения АТФ/АМФ. Таким образом, гликолиз стимулируется, когда энергетический заряд падает. PFK1 имеет два сайта с разным сродством к АТФ, который является одновременно субстратом и ингибитором. [3]
PFK1 также ингибируется низким уровнем pH, что усиливает ингибирующий эффект АТФ. Уровень pH падает, когда мышцы функционируют анаэробно и производят избыточное количество молочной кислоты (хотя молочная кислота сама по себе не является причиной снижения pH [12] ). Этот ингибирующий эффект служит для защиты мышц от повреждений, которые могут возникнуть в результате накопления слишком большого количества кислоты. [3]
Наконец, PFK1 аллостерически ингибируется PEP , цитратом и АТФ. Фосфоенолпировиноградная кислота является продуктом, находящимся дальше по гликолитическому пути. Хотя цитрат действительно накапливается, когда ферменты цикла Кребса достигают максимальной скорости, сомнительно, накапливается ли цитрат до достаточной концентрации, чтобы ингибировать PFK-1 в нормальных физиологических условиях . Увеличение концентрации АТФ указывает на избыток энергии и имеет место аллостерической модуляции на PFK1, где снижается сродство PFK1 к ее субстрату.
PFK1 аллостерически активируется высокой концентрацией AMP , но наиболее мощным активатором является фруктозо-2,6-бисфосфат , который также вырабатывается из фруктозо-6-фосфата с помощью PFK2 . Следовательно, обилие F6P приводит к более высокой концентрации фруктозо-2,6-бисфосфата (F-2,6-BP). Связывание F-2,6-BP увеличивает сродство PFK1 к F6P и уменьшает ингибирующий эффект АТФ. Это пример прямой стимуляции, поскольку гликолиз ускоряется при избытке глюкозы. [3]
Активность ПФК снижается за счет подавления синтеза глюкагоном . Глюкагон активирует протеинкиназу А, которая, в свою очередь, отключает киназную активность PFK2 . Это обращает вспять любой синтез F-2,6-BP из F6P и, таким образом, деактивирует PFK1.
Точная регуляция PFK1 предотвращает одновременное протекание гликолиза и глюконеогенеза . Однако между F6P и F-1,6-BP происходит циклическое изменение субстратов . Фруктозо-1,6-бисфосфатаза (FBPase) катализирует гидролиз F-1,6-BP обратно до F6P, обратную реакцию, катализируемую PFK1. Существует небольшая активность FBPase во время гликолиза и некоторая активность PFK1 во время глюконеогенеза. Этот цикл позволяет усиливать метаболические сигналы, а также выделять тепло за счет гидролиза АТФ.
Серотонин (5-HT) увеличивает PFK путем связывания с рецептором 5-HT(2A), вызывая фосфорилирование тирозинового остатка PFK с помощью фосфолипазы C. Это, в свою очередь, перераспределяет PFK внутри клеток скелетных мышц. Поскольку ПФК регулирует гликолитический поток, серотонин играет регулирующую роль в гликолизе [13].
У человека есть три гена фосфофруктокиназы:
Генетическая мутация в гене PFKM приводит к болезни Таруи , болезни накопления гликогена, при которой нарушается способность определенных типов клеток использовать углеводы в качестве источника энергии. [14]
Болезнь Таруи представляет собой болезнь накопления гликогена, симптомы которой включают мышечную слабость (миопатию), судороги и спазмы, вызванные физической нагрузкой, миоглобинурию (наличие миоглобина в моче, что указывает на разрушение мышц) и компенсированный гемолиз. АТФ является естественным аллостерическим ингибитором ПФК, предотвращающим ненужное производство АТФ посредством гликолиза. Однако мутация в Asp(543)Ala может привести к более сильному ингибирующему эффекту АТФ (из-за повышенного связывания с ингибирующим аллостерическим сайтом связывания PFK). [15] [16]
Мутация фосфофруктокиназы и рак. Чтобы раковые клетки могли удовлетворить свои энергетические потребности благодаря быстрому росту и делению клеток, они выживают более эффективно, если у них есть гиперактивный фермент фосфофруктокиназа 1. [17] [18] Когда раковые клетки быстро растут и делятся, они изначально не имеют достаточного кровоснабжения и, таким образом, могут испытывать гипоксию (недостаток кислорода), и это запускает O-GlcNAcylation по серину 529 PFK. Эта модификация ингибирует активность PFK1 и поддерживает пролиферацию рака, в отличие от мнения, что для рака необходима высокая активность PFK1. Это может быть связано с перенаправлением потока глюкозы на пентозофосфатный путь для генерации НАДФН для детоксикации активных форм кислорода. [19]
Простой герпес типа 1 и фосфофруктокиназа: некоторые вирусы, включая ВИЧ, ЦМВ и Майаро, влияют на клеточные метаболические пути, такие как гликолиз, путем MOI-зависимого увеличения активности ПФК. Механизм повышения активности PFK при герпесе заключается в фосфорилировании фермента по остаткам серина. Гликолиз, индуцированный ВПГ-1, увеличивает содержание АТФ, что имеет решающее значение для репликации вируса. [20]