Аффинная хроматография — метод выделения биомолекулы из смеси, основанный на высокоспецифическом макромолекулярном связывающем взаимодействии между биомолекулой и другим веществом. Конкретный тип связывающего взаимодействия зависит от интересующей биомолекулы; Взаимодействия связывания антигена и антитела , фермента и субстрата , рецептора и лиганда или белка и нуклеиновой кислоты [1] часто используются для выделения различных биомолекул. Аффинная хроматография полезна благодаря своей высокой селективности и разрешению разделения [2] [3] по сравнению с другими хроматографическими методами.
Преимущество аффинной хроматографии заключается в специфическом связывании между интересующим аналитом (обычно растворенным в подвижной фазе ) и партнером по связыванию или лигандом (иммобилизованным на неподвижной фазе ). В типичном эксперименте по аффинной хроматографии лиганд прикрепляется к твердой нерастворимой матрице — обычно полимеру, такому как агароза или полиакриламид , — химически модифицированному для введения реакционноспособных функциональных групп , с которыми лиганд может реагировать, образуя стабильные ковалентные связи. [4] Неподвижную фазу сначала загружают в колонну, в которую вводят подвижную фазу. Молекулы, которые связываются с лигандом, останутся связанными с неподвижной фазой. Затем применяется промывной буфер для удаления нецелевых биомолекул путем разрушения их более слабых взаимодействий с неподвижной фазой, в то время как интересующие биомолекулы останутся связанными. Затем целевые биомолекулы можно удалить, применяя так называемый элюирующий буфер, который нарушает взаимодействие между связанными целевыми биомолекулами и лигандом. Таким образом, целевая молекула восстанавливается в элюирующем растворе. [5] [ нужна страница ]
Аффинная хроматография не требует знания молекулярной массы, заряда, гидрофобности или других физических свойств интересующего аналита, хотя знание его свойств связывания полезно при разработке протокола разделения. [5] Типы связывающих взаимодействий, обычно используемые в процедурах аффинной хроматографии, обобщены в таблице ниже.
Связывание с твердой фазой может быть достигнуто с помощью колоночной хроматографии, при которой твердая среда наносится на колонку, исходная смесь пропускается через колонку для осаждения, промывочный буфер пропускается через колонку, а элюирующий буфер затем наносится на колонку и собирается. . Эти этапы обычно выполняются при атмосферном давлении. Альтернативно связывание может быть достигнуто с использованием периодической обработки, например, путем добавления исходной смеси к твердой фазе в сосуде, перемешивания, отделения твердой фазы, удаления жидкой фазы, промывания, повторного центрифугирования, добавления элюирующего буфера, повторное центрифугирование и удаление элюата.
Иногда используется гибридный метод, при котором связывание осуществляется периодическим методом, но твердая фаза со связанной целевой молекулой набивается на колонку, а на колонке выполняются промывка и элюирование.
Лиганды, используемые в аффинной хроматографии, получают как из органических, так и из неорганических источников. Примерами биологических источников являются сывороточные белки, лектины и антитела. Неорганическими источниками являются мороновая кислота, хелаты металлов и триазиновые красители. [7]
Также был разработан третий метод — абсорбция расширенным слоем, который сочетает в себе преимущества двух упомянутых выше методов. Частицы твердой фазы помещаются в колонну, куда жидкая фаза закачивается снизу и выходит сверху. Гравитация частиц гарантирует, что твердая фаза не выйдет из колонны с жидкой фазой.
Аффинные колонки можно элюировать путем изменения концентрации соли, pH, pI, заряда и ионной силы напрямую или через градиент для разделения интересующих частиц.
Совсем недавно были разработаны установки, в которых последовательно используется более одной колонки. Преимущество по сравнению с установками с одной колонкой заключается в том, что материал смолы может быть полностью загружен, поскольку несвязывающий продукт напрямую переносится в следующую колонку со свежим материалом колонки. Эти хроматографические процессы известны как периодическая противоточная хроматография (ПХХ). Таким образом, затраты на смолу на количество произведенного продукта могут быть значительно снижены. Поскольку одну колонку всегда можно элюировать и регенерировать, в то время как другая колонка загружена, уже двух колонок достаточно, чтобы в полной мере использовать преимущества. [8] Дополнительные колонки могут обеспечить дополнительную гибкость в отношении времени элюирования и регенерации за счет затрат на дополнительное оборудование и смолу.
Аффинную хроматографию можно использовать в ряде приложений, включая очистку нуклеиновых кислот, очистку белков [9] из бесклеточных экстрактов и очистку крови.
Используя аффинную хроматографию, можно отделить белки, которые связываются с определенным фрагментом, от белков, которые не связываются с этим конкретным фрагментом. [10] Поскольку этот метод очистки основан на биологических свойствах необходимого белка, это полезный метод, и белки можно очищать многократно за один этап. [11] [ нужна страница ]
Существует множество различных носителей сходства для самых разных возможных применений. [12] [9] [13] Вкратце, они (в обобщенном виде) активированы/функционализированы и действуют как функциональный спейсер, поддерживающая матрица и исключают обработку токсичных реагентов.
Аминокислотные среды используются с различными сывороточными белками, белками, пептидами и ферментами, а также с рРНК и дцДНК. Авидин-биотиновые среды используются в процессе очистки биотина/авидина и их производных.
Углеводная связь чаще всего используется с гликопротеинами или любым другим углеводсодержащим веществом; углеводы используются с лектинами, гликопротеинами или любыми другими белками-метаболитами углеводов. Красящая лигандная среда неспецифична, но имитирует биологические субстраты и белки. Глутатион полезен для разделения рекомбинантных белков, меченных GST. Гепарин представляет собой обобщенный аффинный лиганд, и он наиболее полезен для разделения белков свертывания плазмы, а также ферментов нуклеиновых кислот и липаз.
Среды гидрофобного взаимодействия чаще всего используются для воздействия на свободные карбоксильные группы и белки.
В иммуноаффинных средах (подробно описанных ниже) для разделения антигенов и антител используется высокая специфичность; Аффинная хроматография с иммобилизованными металлами подробно описана ниже и использует взаимодействия между ионами металлов и белками (обычно специально помеченными) для разделения; нуклеотид/кофермент, который разделяет дегидрогеназы, киназы и трансаминазы.
Нуклеиновые кислоты улавливают мРНК, ДНК, рРНК и другие нуклеиновые кислоты/олигонуклеотиды. Белковый метод A/G используется для очистки иммуноглобулинов.
Специальные среды предназначены для определенного класса или типа белка/кофермента; этот тип среды будет работать только для разделения определенного белка или кофермента.
Другое применение процедуры – аффинная очистка антител из сыворотки крови. Если известно, что сыворотка содержит антитела против определенного антигена (например, если сыворотка получена из организма, иммунизированного против соответствующего антигена), то ее можно использовать для аффинной очистки этого антигена. Это также известно как иммуноаффинная хроматография. Например, если организм иммунизирован против слитого белка GST, он будет вырабатывать антитела против слитого белка и, возможно, также антитела против метки GST. Затем белок можно ковалентно связать с твердой подложкой, такой как агароза, и использовать в качестве аффинного лиганда при очистке антитела из иммунной сыворотки.
Для полноты каждый белок GST и слитый с GST белок можно связать отдельно. Первоначально сыворотке позволяют связываться с аффинной матрицей GST. Это позволит удалить антитела против GST-части слитого белка. Затем сыворотку отделяют от твердой подложки и позволяют ей связаться с матрицей слитого белка GST. Это позволяет любым антителам, распознающим антиген, захватить твердую подложку. Элюцию интересующих антител чаще всего достигают с использованием буфера с низким pH , такого как глицин pH 2,8. Элюат собирают в нейтральный трис- или фосфатный буфер, чтобы нейтрализовать элюирующий буфер с низким pH и остановить любую деградацию активности антитела. Это хороший пример, поскольку аффинная очистка используется для очистки исходного слитого GST белка, удаления нежелательных антител против GST из сыворотки и очистки целевого антитела.
Моноклональные антитела также могут быть выбраны для связывания белков с высокой специфичностью, при этом белок высвобождается в довольно мягких условиях. Это может оказаться полезным для дальнейших исследований в будущем. [14]
Для очистки антител, вырабатываемых против пептидных антигенов , часто используется упрощенная стратегия . Когда пептидные антигены производятся синтетически, терминальный остаток цистеина добавляется либо к N-, либо к C-концу пептида. Этот остаток цистеина содержит сульфгидрильную функциональную группу, которая позволяет пептиду легко конъюгироваться с белком-носителем (например, гемоцианином улитки улитки (KLH)). Тот же самый цистеинсодержащий пептид также иммобилизуют на агарозной смоле через остаток цистеина и затем используют для очистки антитела.
Большинство моноклональных антител были очищены с помощью аффинной хроматографии на основе иммуноглобулин -специфического белка А или белка G , полученного из бактерий. [15]
Иммуноаффинная хроматография с моноклональными антителами, иммобилизованными на монолитной колонке, успешно использовалась для захвата внеклеточных везикул (например, экзосом и экзомеров) из плазмы крови человека путем воздействия на тетраспанины и интегрины, обнаруженные на поверхности ЭВ. [16] [17]
Иммуноаффинная хроматография также является основой для иммунохроматографических тест-полосок (ИКТ), которые обеспечивают быстрое средство диагностики при уходе за пациентами. Используя ИКТ, техник может сделать определение у постели пациента, без необходимости использования лаборатории. [18] Обнаружение ИКТ очень специфично для микроба, вызывающего инфекцию. [19]
Аффинная хроматография с иммобилизованными ионами металлов (IMAC) основана на специфической ковалентной связи аминокислот, особенно гистидина, с металлами. Этот метод работает, позволяя белкам, имеющим сродство к ионам металлов, удерживаться в колонке, содержащей иммобилизованные ионы металлов, таких как кобальт, никель или медь, для очистки гистидинсодержащих белков или пептидов, железа, цинка или галлия для очистки. фосфорилированных белков или пептидов. Многие природные белки не обладают сродством к ионам металлов, поэтому можно использовать технологию рекомбинантной ДНК для введения такой белковой метки в соответствующий ген. Методы, используемые для элюирования интересующего белка, включают изменение pH или добавление конкурентной молекулы, такой как имидазол . [20] [21]
Возможно, наиболее распространенным применением аффинной хроматографии является очистка рекомбинантных белков. Белки с известным сродством помечаются белками , чтобы облегчить их очистку. Белок мог быть генетически модифицирован, чтобы его можно было выбрать для аффинного связывания; это известно как гибридный белок. Белковые метки включают гексагистидин ( His ), глутатион -S-трансферазу (GST), мальтозосвязывающий белок (MBP) и метку CL7 варианта колицина E7. Гистидиновые метки обладают сродством к ионам никеля , кобальта , цинка , меди и железа , которые иммобилизованы путем образования координационных ковалентных связей с хелатором, включенным в неподвижную фазу. Для элюирования используют избыточное количество соединения, способного действовать как лиганд иона металла, такого как имидазол . GST имеет сродство к глутатиону, который коммерчески доступен в виде иммобилизованной глутатион-агарозы. Во время элюирования избыток глутатиона используется для вытеснения меченого белка. CL7 обладает сродством и специфичностью к белку иммунитета 7 (Im7), который коммерчески доступен в виде иммобилизованной агарозной смолы Im7. Для элюирования на смолу Im7 наносится активная и сайт-специфическая протеаза для высвобождения белка, не содержащего меток. [22]
Аффинная хроматография с лектинами — это форма аффинной хроматографии, при которой лектины используются для разделения компонентов в образце. Лектины, такие как конканавалин А, представляют собой белки, которые могут связывать специфические молекулы углеводов альфа-D-маннозы и альфа-D-глюкозы. Некоторыми распространенными углеводными молекулами, которые используются в аффинной хроматографии с лектинами, являются Con A-сефароза и WGA-агароза. [23] Другим примером лектина является агглютинин зародышей пшеницы, который связывает DN-ацетил-глюкозамин. [24] Наиболее распространенным применением является отделение гликопротеинов от негликозилированных белков или одной гликоформы от другой гликоформы. [25] Хотя существуют различные способы проведения аффинной хроматографии с лектинами, цель состоит в том, чтобы извлечь сахарный лиганд желаемого белка. [23]
Другое применение аффинной хроматографии — очистка конкретных белков с использованием гелевой матрицы, уникальной для конкретного белка. Например, очистку β-галактозидазы E. coli осуществляют с помощью аффинной хроматографии с использованием п-аминобенил-1-тио-β-D-галактопиранозилагарозы в качестве аффинной матрицы. В качестве аффинной матрицы используется п-аминобенил-1-тио-β-D-галактопиранозилагароза, поскольку она содержит галактопиранозильную группу, которая служит хорошим аналогом субстрата для β-галактозидазы E. coli. Это свойство позволяет ферменту связываться с неподвижной фазой аффинной матрицы, и β-галактозидаза элюируется при добавлении в колонку возрастающей концентрации соли. [26]
Щелочную фосфатазу из E. coli можно очистить с использованием матрицы DEAE-целлюлозы. А. фосфатаза имеет небольшой отрицательный заряд, что позволяет ей слабо связываться с положительно заряженными аминогруппами в матрице. Затем фермент можно элюировать путем добавления буфера с более высокими концентрациями соли. [27]
Борнатная аффинная хроматография заключается в использовании бороновой кислоты или боронатов для элюирования и количественного определения количества гликопротеинов . В клинических адаптациях этот тип хроматографии был применен для определения долгосрочной оценки пациентов с диабетом посредством анализа их гликированного гемоглобина . [24]
Аффинная очистка примесей альбумина и макроглобулина помогает удалить избыток альбумина и примесей α 2 -макроглобулина при проведении масс-спектрометрии. При аффинной очистке сывороточного альбумина стационарным средством, используемым для сбора или привлечения сывороточных белков, может быть сибакрон-синяя сефароза. Затем белки сыворотки можно элюировать с адсорбента буфером, содержащим тиоцианат (SCN- ) . [28]
Слабая аффинная хроматография [29] ( WAC ) представляет собой метод аффинной хроматографии для скрининга аффинности при разработке лекарств. [30] [31] WAC — это метод жидкостной хроматографии на основе сродства, который разделяет химические соединения на основе их различного слабого сродства к иммобилизованной мишени. Чем выше сродство соединения к мишени, тем дольше оно остается в установке разделения, и это будет выражаться в более длительном времени удерживания. Меру сродства и ранжирование сродства можно получить путем обработки полученных времен удерживания анализируемых соединений. Аффинная хроматография является частью более широкого набора методов, используемых для идентификации целевых лекарственных средств на основе хемопротеомики .
Технология WAC продемонстрирована на ряде различных белковых мишеней – протеаз , киназ , шаперонов и мишеней белок-белкового взаимодействия (PPI). Было показано, что WAC более эффективен, чем традиционные методы скрининга на основе фрагментов. [31]
Аффинная хроматография была задумана и впервые разработана Педро Куатрекасасом и Меиром Вильчеком . [32] [33]
Аффинная хроматография — новый метод, разработанный Куатрекасасом и Вильчеком.