При молекулярном клонировании вектором является любая частица (например, плазмиды , космиды , лямбда-фаги ) , используемая в качестве носителя для искусственного переноса чужеродной нуклеиновой последовательности – обычно ДНК – в другую клетку , где она может быть реплицирована и/или экспрессирована . [1] Вектор, содержащий чужеродную ДНК, называется рекомбинантной ДНК . Четырьмя основными типами векторов являются плазмиды , вирусные векторы , космиды и искусственные хромосомы . Из них наиболее часто используемыми векторами являются плазмиды. [2] Общими для всех сконструированных векторов являются точка начала репликации , сайт мультиклонирования и селектируемый маркер .
Сам вектор обычно несет последовательность ДНК , состоящую из вставки (в данном случае трансгена ) и более крупной последовательности, которая служит «основой» вектора. Цель вектора, который передает генетическую информацию в другую клетку, обычно состоит в том, чтобы изолировать, размножить или экспрессировать вставку в клетке-мишени. Все векторы могут использоваться для клонирования и, следовательно, являются клонирующими векторами , но существуют также векторы, разработанные специально для клонирования, в то время как другие могут быть разработаны специально для других целей, таких как транскрипция и экспрессия белка. Векторы, разработанные специально для экспрессии трансгена в клетке-мишени, называются векторами экспрессии и обычно имеют промоторную последовательность, которая управляет экспрессией трансгена. Более простые векторы, называемые векторами транскрипции, способны только транскрибироваться, но не транслироваться: они могут реплицироваться в клетке-мишени, но не экспрессироваться, в отличие от векторов экспрессии. Векторы транскрипции используются для амплификации их вставки.
Манипуляции с ДНК обычно проводятся с векторами E.coli , которые содержат элементы, необходимые для их поддержания в E.coli . Однако векторы могут также содержать элементы, которые позволяют им сохраняться в другом организме, таком как дрожжи, клетки растений или млекопитающих, и эти векторы называются челночными векторами . Такие векторы содержат бактериальные или вирусные элементы, которые могут быть перенесены в небактериальный организм-хозяин, однако были разработаны и другие векторы, называемые внутригенными векторами, чтобы избежать переноса любого генетического материала от чужеродного вида. [3]
Вставку вектора в клетку-мишень обычно называют трансформацией для бактериальных клеток, [4] — трансфекцией для эукариотических клеток, [5] хотя вставку вирусного вектора часто называют трансдукцией. [6]
Плазмиды представляют собой двухцепочечные дополнительные хромосомные и, как правило, кольцевые последовательности ДНК, которые способны к репликации с использованием механизма репликации клетки-хозяина. [7] Плазмидные векторы минималистично состоят из точки начала репликации , которая обеспечивает полунезависимую репликацию плазмиды в хозяине. Плазмиды широко распространены у многих бактерий, например, у Escherichia coli , но также могут быть обнаружены у некоторых эукариот, например, у дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae . [8] Бактериальные плазмиды могут быть конъюгативными/трансмиссивными и неконъюгативными:
Плазмиды со специально созданными характеристиками обычно используются в лабораториях для целей клонирования . Эти плазмиды, как правило, неконъюгативны, но могут иметь множество других особенностей, в частности, « множественный сайт клонирования », где несколько сайтов расщепления ферментом рестрикции позволяют вставить трансгенную вставку. Бактерии, содержащие плазмиды, могут за часы генерировать миллионы копий вектора внутри бактерий, а амплифицированные векторы можно извлечь из бактерий для дальнейших манипуляций. Плазмиды могут использоваться конкретно в качестве векторов транскрипции, и такие плазмиды могут отсутствовать важные последовательности для экспрессии белка. Плазмиды, используемые для экспрессии белка, называемые векторами экспрессии , будут включать элементы для трансляции белка, такие как сайт связывания рибосомы , стартовые и стоп-кодоны .
Вирусные векторы представляют собой генно-инженерные вирусы, несущие модифицированную вирусную ДНК или РНК, которая стала неинфекционной, но все еще содержит вирусные промоторы и трансген, что позволяет транслировать трансген через вирусный промотор. Однако, поскольку вирусным векторам часто не хватает инфекционных последовательностей, для крупномасштабной трансфекции им требуются вирусы-помощники или упаковочные линии. Вирусные векторы часто конструируются так, чтобы навсегда включать вставку в геном хозяина и, таким образом, оставлять в геноме хозяина отдельные генетические маркеры после включения трансгена. Например, ретровирусы после вставки оставляют характерный образец ретровирусной интеграции , который можно обнаружить и указывает на то, что вирусный вектор включился в геном хозяина.
Искусственные хромосомы представляют собой искусственные хромосомы в контексте дрожжевых искусственных хромосом (YAC), бактериальных искусственных хромосом (BAC) или искусственных хромосом человека (HAC). Искусственная хромосома может нести гораздо больший фрагмент ДНК, чем другие векторы. [9] YAC и BAC могут нести фрагмент ДНК длиной до 300 000 нуклеотидов. Три структурные потребности искусственной хромосомы включают начало репликации, центромеру и концевые теломерные последовательности. [10]
Транскрипция клонированного гена является необходимым компонентом вектора, когда требуется экспрессия гена: один ген может быть амплифицирован посредством транскрипции для создания множества копий мРНК , матрицы, на которой белок может быть получен посредством трансляции. [11] Большее количество мРНК будет экспрессировать большее количество белка, и количество создаваемых копий мРНК зависит от промотора, используемого в векторе. [12] Экспрессия может быть конститутивной, что означает, что белок вырабатывается постоянно в фоновом режиме, или она может быть индуцируемой, при которой белок экспрессируется только при определенных условиях, например, когда добавляется химический индуктор. Эти два разных типа экспрессии зависят от типов используемых промотора и оператора .
Вирусные промоторы часто используются для конститутивной экспрессии в плазмидах и вирусных векторах, поскольку они обычно надежно обеспечивают постоянную транскрипцию во многих клеточных линиях и типах. [13] Индуцируемая экспрессия зависит от промоторов, которые реагируют на условия индукции: например, промотор вируса опухоли молочной железы мышей инициирует транскрипцию только после применения дексаметазона , а промотор теплового шока дрозофилы инициируется только после высоких температур.
Некоторые векторы предназначены только для транскрипции, например, для производства мРНК in vitro . Эти векторы называются векторами транскрипции. У них может отсутствовать последовательность, необходимая для полиаденилирования и терминации, поэтому их нельзя использовать для производства белка.
Векторы экспрессии производят белки посредством транскрипции вставки вектора с последующей трансляцией полученной мРНК , поэтому для них требуется больше компонентов, чем для более простых векторов , предназначенных только для транскрипции. Для экспрессии в разных организмах-хозяевах потребуются разные элементы, хотя они имеют схожие требования, например, промотор для инициации транскрипции, сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и сигналы терминации.
Векторам экспрессии эукариот требуются последовательности, которые кодируют:
Современные искусственно созданные векторы содержат существенные компоненты, присутствующие во всех векторах, и могут содержать другие дополнительные функции, встречающиеся только в некоторых векторах:
