Картофельный вирус Y (PVY) — фитопатогенный вирус семейства Potyviridae и один из важнейших фитовирусов, поражающих производство картофеля .
Инфекция PVY растений картофеля приводит к различным симптомам в зависимости от штамма вируса . Самым мягким из этих симптомов является потеря продукции, но самым пагубным является «некротическая кольцевая пятнистость клубней картофеля» (PTNRD). Некротическая кольцевая пятнистость делает картофель непригодным для продажи и, следовательно, может привести к значительной потере дохода. PVY передается тлями -переносчиками, но может также оставаться в спящем состоянии в семенном картофеле. Это означает, что использование одной и той же линии картофеля для производства семенного картофеля в течение нескольких последовательных поколений приведет к прогрессивному увеличению вирусной нагрузки и последующей потере урожая .
Рост заражения растений картофеля вирусами за последние несколько лет привел к значительным потерям в южноафриканской картофельной промышленности. Рост уровня заражения может быть обусловлен несколькими факторами. К ним относятся заметное снижение эффективности и применения химикатов, используемых для борьбы с переносчиками, использование зараженного семенного картофеля при выращивании, неправильные методы орошения и ведения сельского хозяйства, а также отсутствие чувствительного, быстрого и надежного метода обнаружения. [1] Повышение средней температуры зимой в результате глобального потепления также привело к увеличению численности тли, что, в свою очередь, привело к увеличению распространения вируса. [1] [ необходима цитата ]
PVY принадлежит к роду Potyvirus , крупнейшему роду вирусов растений и, возможно, самому разрушительному для картофельных культур. [2] Род включает более 200 видов , которые наносят значительный ущерб сельскому хозяйству. [3] PVY поражает многие экономически важные виды растений. К ним относятся картофель ( Solanum tuberosum ), табак ( Nicotiana tabacum ), томат ( Solanum lycopersicum ) и перец ( Capsicum spp.). [4] Уровень повреждения урожая определяется штаммом PVY, инфицирующим растения, вирусной нагрузкой, временем, когда происходит заражение, а также толерантностью хозяина к вирусу. [5] Устойчивость хозяев к заражению PVY во многих случаях низкая. Заражение картофельного поля PVY может в конечном итоге привести к потере урожая на 10–100%. [5]
Было показано, что PVY имеет различные изоляты в соответствии с симптомами, которые они вызывают у различных видов растений картофеля. [6] Обширная биологическая, серологическая и молекулярная изменчивость изолятов PVY делает классификацию изолятов как отдельных штаммов особенно сложной. Возникновение различных симптомов и появление некротического PVY NTN привело к поиску более надежных инструментов классификации, чем простая серологическая идентификация. Традиционно различают три основных штамма PVY: PVY C , PVY N и PVY O. PVY C , первоначально известный как вирус картофеля C , был признан первым и был идентифицирован в 1930-х годах. [7] PVY C вызывает гиперчувствительные реакции у широкого спектра сортов картофеля. Эти реакции включают образование мягких мозаичных узоров или штриховатых полос. В отличие от других штаммов PVY, некоторые штаммы PVY C не передаются тлей. [8] Предыдущие исследования Виссера и др. [9] не идентифицировали ни один из местных изолятов как PVY C, но сообщалось, что он встречается в картофеле в Южной Африке. [10] [11] Второй штамм PVY — PVY N. [12] Этот штамм был описан в растениях табака, растущих рядом с растениями картофеля. [13] PVY N вызывает некроз листьев и легкие или даже не вызывает повреждения клубней. Обычный штамм PVY обозначается как PVY O. Заражение растения картофеля штаммом PVY O приводит к легким повреждениям клубней и не вызывает некроза листьев. [14] Оба штамма PVY N и PVY O передаются тлей и встречаются в Южной Африке. В Европе было показано, что эти два штамма рекомбинируют, образуя PVY NTN . [15] [16] PVY NTN был аккредитован как способный вызывать заболевание некротической кольцевой пятнистости клубней картофеля (PTNRD). [15] Клубни, поврежденные PTNRD, становятся непригодными для продажи, а заражение PVY NTN приводит к большему экономическому ущербу, чем заражение другими штаммами.
PVY может передаваться растениям картофеля через прививку , инокуляцию сока растений и через передачу тлей . Наиболее распространенным способом заражения PVY растительного материала в поле является заражение тлей, и хотя тли сами по себе могут напрямую повреждать растения картофеля, именно их роль в качестве вирусных переносчиков имеет наибольшее экономическое воздействие. [17] [18] [19] В холодном климате тли проводят зиму либо как бескрылые тли, рождающие живых детенышей (viviparae), либо как яйца. Хозяева, такие как сорняки и другие культуры, служат местом размножения этих тлей и образуют временную область колонизации до того, как тли мигрируют на картофельные поля. [18] В умеренном климате, например, в Южной Африке, считается, что тли размножаются бесполым путем на сорняках, других культурах, местных растениях и садовых растениях. Это означает, что некоторое количество тлей присутствует круглый год. Важность эффективного и строгого мониторинга популяций тли подчеркивается в обзоре Рэдклиффа и Рэгсдейла (2002), поскольку вирионы PVY попадают на картофельные поля почти исключительно через крылатых тлей из источника вируса за пределами этих полей. Бескрылые тли пока не связаны с распространением PVY на картофельных полях. [20]
Было обнаружено, что зеленая персиковая тля ( Myzus persicae ) наиболее эффективна в своей роли вирусного переносчика, [5] [17] [21] но другие, такие как Aphis fabae , Aphis gossypii , Aphis nasturtii , Macrosiphum euphorbiae , Myzus (Nectarosiphon) certus , Myzus (Phorodon) humuli и Rhopalosiphum insertum, также тесно связаны с передачей вируса. [17] [21] Совет по сельскохозяйственным исследованиям - Институт овощных и декоративных растений (ARC-VOPI) 6 Южной Африки идентифицировал двадцать пять видов тлей, способных функционировать в качестве переносчиков PVY. [22] Эффективность некоторых из этих тлей в качестве переносчиков PVY была также установлена (Ragsdale et al., 2001) и, как было обнаружено, различается между различными видами. В Южной Африке Aphis fabae , Aphis gossypii и Aphis nasturtii являются наиболее распространенными и эффективными переносчиками PVY, обнаруженными в полевых условиях. [5] Помимо классификации по эффективности в качестве переносчиков, тли также можно разделить на две подгруппы, а именно колонизирующие и неколонизирующие виды. Колонизирующие тли — это тли, которые размножаются и обосновываются на растениях картофеля, в частности, в то время как неколонизирующие тли не размножаются и не обосновывают колонии на растениях картофеля. Колонизирующие тли лучше приспособлены к жизни на растениях картофеля и, таким образом, обычно считаются лучшими переносчиками PVY, чем неколонизирующие тли. Неколонизирующие тли в основном не питаются растениями картофеля, но иногда питаются ими в поисках более подходящего хозяина. Их более низкая эффективность в качестве переносчиков PVY компенсируется огромным количеством, в котором они встречаются. [19] [23] По этой причине все виды тли, присутствующие на картофельных полях и вокруг них, должны рассматриваться как возможные переносчики, а их численность должна тщательно контролироваться.
Передача PVY тлями происходит непостоянным, нециркуляционным образом, что предполагает менее тесное взаимодействие между вирионом и вектором, чем в случае циркуляционных вирионов. [24] Тот факт, что вирионы передаются непостоянным образом, означает, что репликация вируса не происходит внутри тли-переносчика и что, если тля не питается инфицированными растениями, она теряет способность заражать растения после двух-трех кормлений. [5] [25] Вирионы прикрепляются к стилету тли за считанные секунды и могут оставаться заразными в течение четырех-семнадцати часов. [26] [27] Расстояние, на которое могут передаваться вирионы, ограничено из-за короткого периода, в течение которого они остаются заразными. [23] Хотя короткая продолжительность жизни вне растений подавляет передачу вируса на большие расстояния, это не снижает эффективность передачи, обеспечиваемую быстрой скоростью приобретения вируса и инокуляции в пределах поля.
При попадании в растительную клетку вирусный белок оболочки разбирается и высвобождает свой РНК- геном. Вирусная РНК служит мРНК , и хотя о ее трансляции известно немного, считается, что 5'-некодирующая область функционирует как усилитель трансляции. [28] Транслированная мРНК приводит к образованию полипротеина, который преобразуется в зрелые белки. Затем каждый полипротеин расщепляется на десять различных белков, которые, как полагают, являются многофункциональными. Эти белки вместе с белками хозяина собираются, образуя репликационный комплекс. Этот комплекс выполняет синтез отрицательной цепи РНК, используя положительную цепь вирусной РНК в качестве матрицы. После того, как дополнительные копии РНК были получены, они кодируют синтез различных белков, как упоминалось ранее, а также белков оболочки. Эти белки оболочки теперь будут заключать в себе вновь сформированные геномы, чтобы дать начало новым вирионам . Было высказано предположение, что включение новообразованных вирионов инициируется взаимодействием белков оболочки с 5'-концом, а белок оболочки наращивается по направлению к 3'-концу. [29] Весь процесс репликации вируса происходит в эндоплазматическом ретикулуме . Эти новосинтезированные вирусные частицы впоследствии транспортируются через плазмодесмы в соседние растительные клетки с помощью нескольких вспомогательных белков потивируса. Распространение вирусов внутри растения происходит в соответствии с соотношением источник-приемник между созревающими и растущими тканями. [30] Концентрация вируса по всему растению высока, и это значительно увеличивает вероятность его захвата тлями. Заражение растений потивирусами может различаться по проявляемым симптомам. Заражение может включать некроз жилок, мозаичные симптомы, а также деформацию листьев (Boonham et al., 2002). Зараженные растения, у которых не проявляются симптомы, могут иметь инфицированные полога и давать продукцию более низкого качества, чем их здоровые аналоги.
Поскольку PVY NTN вызывает большие потери в производстве картофеля, исследование взаимодействия картофеля и картофельного вируса Y NTN имеет важное значение. Чувствительные сорта картофеля реагируют на инокуляцию PVY NTN развитием типичных симптомов. На инокулированных листьях через 5–7 дней после инокуляции развиваются хлоротические и некротические кольцевые пятна. По мере распространения вируса по растению системные симптомы развиваются на неинокулированных листьях. Через 10 дней после инокуляции появляются морщины и мозаичный хлороз, что приводит к появлению пальмового вида (опадание листьев).
Механизмы вирусной защиты растений в первую очередь будут пытаться ограничить движение вируса. В случае неудачи он может попытаться вызвать гибель клеток в инфицированной ткани, тем самым предотвращая распространение вирионов. [31] Хотя точный механизм индукции заболевания потивирусами в растениях неизвестен, известно, что эти вирусы вызывают значительное отключение экспрессии генов хозяина во время репликации вируса. [32] [33] [34]
Физиологические изменения в растениях картофеля в ответ на инфекцию PVY NTN интенсивно изучались. На ранних стадиях инфекции, то есть в течение первых 12 часов, было показано, что гены, связанные с фотосинтезом, гены, участвующие в восприятии, сигнализации и защитной реакции, были выражены по-разному. [34] Через 24 часа после инокуляции количество салициловой кислоты увеличилось. [35]
Нарушение экспрессии генов нарушает нормальную клеточную функцию клеток, что может быть причиной физических симптомов, которые демонстрирует растение. Во время развития симптомов исследование взаимодействия между восприимчивым сортом картофеля и PVY NTN показало изменения уровня цитокинина. [36] В инокулированных листьях, показывающих симптомы, были обнаружены изменения в структуре и размере хлоропластов [37], более низкие уровни хлорофилла и дифференциальная активность растворимых и ионно-связанных пероксидаз [38] .
На более поздних стадиях заражения PVY NTN общая концентрация белка увеличилась в чувствительном сорте картофеля, тогда как в толерантных и умеренно толерантных сортах картофеля таких выраженных изменений не наблюдалось. [39] Исследования экспрессии генов выявили изменения в экспрессии генов белков теплового шока, каталазы, β-1,3-глюканазы и генов, участвующих в фотосинтезе. [33]
Вирионы потивируса состоят из не имеющих оболочки нитевидных структур длиной 680–900 нм и шириной от 11 до 15 нм. [40] Морфологически капсид потивируса состоит приблизительно из 2000 копий белка оболочки (CP). [30]
Капсид инкапсулирует одну нить положительной смысловой РНК, которая имеет длину порядка 10 кб и имеет нетранслируемую 5'-концевую область (5'-NTR), а также 3'-поли-A хвост . [41] [42] Положительный смысловой геном содержит одну расширенную открытую рамку считывания и действует непосредственно как мРНК. 144 нуклеотида 5'-NTR особенно богаты остатками аденина и имеют очень мало остатков гуанина . Вместо обычной структуры колпачка, 5'NTR связан с вирусным геномным связанным белком ( VPg ), который, как говорят, действует как усилитель транскрипции. [28]
5'-лидерная последовательность имеет внутренний сайт входа рибосомы (IRES) и кэп-независимые элементы регуляции трансляции (CIRE). [43] IRES управляет кэп-независимой трансляцией через механизм, аналогичный тому, который используется эукариотами. [44] Расширенная открытая рамка считывания кодирует полипротеин 350 кДа. Этот полипротеин протеолитически обрабатывается вирусными протеазами (NIa, HC-Pro и P1) и подвергается ко- и посттрансляционному расщеплению с образованием нескольких многофункциональных белков. К ним относятся следующие: P1 (белок P1), HCPro (протеиназа компонента помощника), P3 (белок P3), 6K1 (белок 1 6 кДа), CI (цилиндрическое включение), 6K2 (белок 2 6 кДа), VPg (вирусный белок, связанный с геномом), NIaPro (ядерный белок включения a, домен протеиназы), NIb (ядерный белок включения b) и CP (белок оболочки). [30]
В прошлом посевы визуально осматривались, чтобы определить, свободны ли они от болезней. Визуальный осмотр также использовался в качестве основы для сертификации семян. Определение вирусного статуса посредством визуального осмотра невероятно сложно, поскольку симптомы могут быть замаскированы или инфекция может быть латентной. [23] В результате были введены послесезонные тесты и проверки. Эти тесты включали выращивание ранее собранного материала в теплицах. Полученные растения осматривались для более точной оценки вирусного статуса. Хотя этот метод скрининга действительно предлагал некоторую степень мониторинга присутствия вируса, он был субъективным и крайне неэффективным. Скрининг посевов и семенного картофеля с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) заменил визуальный осмотр в начале 1970-х годов. Использование ИФА предоставило обычным диагностическим лабораториям быстрый, эффективный и чувствительный метод скрининга на широкий спектр вирусов растений картофеля.
Обнаружение патогенов с помощью ИФА основано на взаимодействии антигена и специфических антител и стало популярным и экономически эффективным средством рутинного обнаружения. В ИФА твердая фаза может быть покрыта интересующим образцом, содержащим антиген. [45] Эффективность, с которой антиген связывается с твердой фазой, зависит от температуры, продолжительности воздействия, а также концентрации. [45] Используемые твердые фазы включают нитроцеллюлозные мембраны, бумагу, стекло, агарозу и полистирольные или поливинилхлоридные микротитровальные планшеты. Микротитровальные планшеты являются наиболее широко используемой твердой фазой, поскольку они просты в обращении, допускают автоматизацию и анализ с использованием ридеров микротитровальных планшетов. Недостатком этих планшетов является то, что они обладают высокой абсорбционной способностью, и это увеличивает частоту неспецифического связывания компонентов, используемых в ИФА. Неспецифическое связывание с пластинами уменьшается за счет использования буферов, содержащих белки, такие как казеин, и неионных детергентов, таких как Твин 20. После покрытия избыток образца удаляется, и пластина обычно обрабатывается 1% раствором, содержащим казеин. После этого твердая фаза обрабатывается антителами, полученными против интересующего антигена. После каждого этапа инкубации пластина промывается Твином 20, содержащим PBS. Эти этапы промывки направлены на то, чтобы смыть любые неспецифически связанные компоненты. [46] Неспецифически связанные компоненты связаны менее прочно, чем специфически связанные. Детекция достигается либо путем добавления антитела, связанного с ферментом, либо путем добавления и обнаружения биотинилированного антитела. В системе, использующей антитело, связанное с ферментом, последующее добавление соответствующего субстрата приводит к образованию цвета, пропорционального количеству антигена. [46] В качестве альтернативы пластина может быть покрыта антителом с последующей инкубацией с образцом, который необходимо обнаружить. Это, в свою очередь, может быть обнаружено, как описано выше, и тогда это называется двойным антителом-сэндвичем (DAS) ELISA. Однако обе эти системы имеют недостаток, заключающийся в том, что соединение фермента с антителом может привести к стерическому затруднению , которое, в свою очередь, может привести к потере функции антитела и/или фермента. [47] Это можно преодолеть с помощью моста биотин-авидин или биотин-стрептавидин. В этом типе системы биотинсвязывается с антителом. Молекула биотина не влияет на работу антител и легко обнаруживается с помощью авидина или стрептавидина, конъюгированных с подходящим ферментом. Стрептавидин имеет чрезвычайно высокое сродство к биотину, что приводит к еще более высокой степени специфичности, чем система, в которой фермент связывается непосредственно с антигеном. Чтобы установить, присутствует ли антиген, добавляется субстрат, специфичный для используемого фермента. Затем фермент преобразует субстрат в окрашенный продукт, и интенсивность цвета может быть соотнесена с количеством связанных антител и, таким образом, количеством присутствующего антигена. DAS-ELISA имеет то преимущество, что он может повысить специфичность ELISA и уменьшить возникновение неспецифического связывания. В результате принцип DAS-ELISA обычно используется в ELISA для обнаружения фитопатогенов в соке растений без предварительной очистки патогена.
ELISA считается безопасным, недорогим и быстрым методом обнаружения вирусов растений. Его дешевизна и относительная простота позволяют использовать его в качестве рабочей лошадки в сельскохозяйственном секторе и использовать для скрининга тысяч образцов в год. К сожалению, ELISA не полностью безотказны. Уровни вирусов в клубнях картофеля, которые проверяются ELISA для использования в качестве семенного картофеля, обычно низкие, пока клубни находятся в состоянии покоя. Обнаружение вирусов в этом картофеле с помощью ELISA затруднено, и значения поглощения могут быть ниже установленного порогового значения. По этой причине скрининг семенных клубней проводится на прорастающих, а не на спящих клубнях. Хотя это приводит к более надежным показаниям, чем прямое тестирование клубней, это задерживает сертификацию семенного картофеля. [48] Другим недостатком метода обнаружения на основе иммунологии является то, что изменения на уровне гена могут влиять на иммуногенность обнаруживаемого антигена. Что касается вирусов растений картофеля, мутации в гене CP могут привести к тому, что CP претерпит конформационные изменения, что сделает антитела, вырабатываемые против ранее присутствующего вируса, менее эффективными.
Полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) стала мощным и эффективным методом обнаружения вирусов растений картофеля в растительном материале картофеля и даже в спящем картофеле. Для анализа с помощью ОТ-ПЦР требуется всего лишь небольшой кусочек растительного материала. Учитывая протокол, описанный в этой диссертации, 0,1 г растительного материала достаточно для 14 500 отдельных реакций. Во время ОТ-ПЦР специфические целевые последовательности РНК экспоненциально амплифицируются в копии ДНК. Однако для этого РНК вируса сначала должна быть транскрибирована в ДНК с помощью полимеразы обратной транскриптазы. Эта полимераза синтезирует цепь ДНК, используя РНК в качестве матрицы. Это приводит к образованию комплекса ДНК/РНК. Для синтеза цепи ДНК из матрицы РНК требуется только обратный праймер, поскольку РНК представляет собой одну цепь, расположенную от 5' до 3'. Впоследствии вновь синтезированная цепь ДНК используется в качестве матрицы для традиционной ПЦР.
Различные типы полимераз обратной транскриптазы доступны для удовлетворения различных потребностей и условий реакции. Обычно используемые ферменты обратной транскриптазы включают AMV RT, SuperScript III, ImProm-II, Omniscript, Sensiscript и Tth RT. В конце этапа ОТ фермент полимеразы активируется теплом. Также может быть, что полимераза обратной транскриптазы и ДНК-полимераза являются одним и тем же ферментом, и что ферменту требуется только этап активации ДНК-полимеразы после этапа ОТ. Примером такого фермента является полимераза Tth. Этот фермент обладает как активностью РНК-зависимой обратной транскриптазы, так и активностью ДНК-зависимой полимеразы. Однако активный центр ДНК-полимеразы покрыт специальными олигонуклеотидами , называемыми аптамерами . При температурах ниже оптимальной температуры реакции компонент ДНК-зависимой полимеразы Tth остается покрытым аптамерами. При этих температурах фермент Tth синтезирует только копию ДНК шаблона РНК. После повышения температуры реакции до 95 °C аптамеры удаляются, и ДНК-зависимый полимеразный компонент начинает амплифицировать целевую последовательность.
ПЦР-амплификация целевой ДНК происходит в три этапа: денатурация , отжиг и удлинение. [46] Каждый из этих этапов происходит при определенной температуре в течение фиксированного периода времени. Денатурация обычно происходит при температуре от 90 до 95 °C и приводит к диссоциации цепей ДНК. После этого реакция охлаждается до температуры от 40 до 70 °C, чтобы праймеры могли связаться с соответствующими целевыми последовательностями. Этот этап известен как этап отжига и является специфичным для праймера. Температура, при которой отжигаются праймеры, имеет решающее значение. Слишком высокие температуры не позволят праймерам связаться с ДНК, что приведет к отсутствию или плохой амплификации. Слишком низкая температура отжига в конечном итоге приведет к неспецифическому связыванию праймеров и неспецифической амплификации. [46] Праймеры, связанные с областями, фланкирующими целевую ДНК, обеспечивают 3'-гидроксильные группы для удлинения, катализируемого ДНК-полимеразой. Наиболее часто используемой ДНК-полимеразой является Taq , термостабильный фермент, выделенный из термофильной бактерии Thermus aquaticus . ДНК-полимераза синтезирует новые цепи ДНК вдоль цепей-шаблонов, используя праймеры в качестве отправных точек. На этапе удлинения цепи амплифицируются за пределами целевой ДНК. Это означает, что каждая вновь синтезированная цепь ДНК будет иметь область, комплементарную праймеру. Существует экспоненциальное увеличение количества продуцируемой ДНК, поскольку три вышеупомянутых шага повторяются циклически. В традиционной ПЦР эти шаги могут повторяться от 20 до 55 раз. Однако проблема с ПЦР-амплификацией заключается в том, что температура, необходимая для диссоциации цепи ДНК, также приводит к денатурации ДНК-полимеразы. Это частично преодолевается биоинженерией полимераз, которые более термостабильны и имеют более длительный период полураспада.
Несмотря на то, что ОТ-ПЦР технически сложнее в выполнении и дороже, чем ИФА, она позволяет обнаруживать низкие вирусные нагрузки. ОТ-ПЦР считается в 102–105 раз более чувствительной, чем традиционный ИФА. [49] ОТ-ПЦР также позволяет обнаруживать несколько вирусных мишеней в одной реакции с помощью нескольких комбинаций праймеров. Это называется мультиплексированием. Хотя мультиплексирование технически более сложно, чем традиционная симплексная реакция, оно обеспечивает более высокую пропускную способность, поскольку один образец может быть протестирован на несколько вирусных штаммов в одной реакции. Праймеры, используемые для мультиплексирования, выбираются таким образом, чтобы они приводили к ампликонам различных размеров. Это позволяет проводить пост-ОТ-ПЦР-анализ с использованием гель-электрофореза. Хотя ОТ-ПЦР экономит время, допускает мультиплексирование и более чувствительна, чем ИФА, необходимые реагенты и приборы являются дорогостоящими и требуют более высокого уровня технических знаний. Кроме того, анализ конечного продукта с использованием гель-электрофореза является трудоемким, относительно более дорогим, занимает много времени и не поддается автоматизации. По этим причинам использование ОТ-ПЦР для рутинного скрининга нецелесообразно и не заменило ИФА. Однако он дает отрасли возможность скрининга пограничных случаев, особенно в случае сертификации семенного картофеля.
В большинстве традиционных ПЦР полученные продукты анализируются после завершения ПЦР. Это называется анализом конечной точки и обычно носит качественный, а не количественный характер. Для такого рода анализа продукты в основном анализируются на агарозном геле и визуализируются с использованием бромистого этидия в качестве флуоресцентного красителя . Прямая корреляция между силой сигнала и начальной концентрацией образца невозможна при использовании анализа конечной точки, поскольку эффективность ПЦР снижается по мере приближения реакции к фазе плато. Однако количественная ПЦР предлагает точную и быструю альтернативу традиционной ПЦР. Количественная ПЦР дает исследователю возможность амплифицировать и анализировать продукт в одной пробирке с использованием флуоресцентных красителей. Это известно как гомогенная ПЦР. Во время количественной ПЦР увеличение флуоресценции коррелирует с увеличением продукта. Благодаря использованию различных специфических красителей количественная ПЦР может использоваться для различения различных штаммов вируса и даже для обнаружения точечных мутаций. Основным преимуществом количественной ПЦР является то, что анализ полученных продуктов с использованием гель-электрофореза не требуется. Это означает, что количественную ПЦР можно использовать как высокопроизводительный метод скрининга образцов.
Количественная ПЦР была описана для обнаружения [50] и различения изолятов PVY O и PVY N [51] [52] и для надежного различения изолятов PVY NTN и PVY N. [53]