Цитогенетика по сути является разделом генетики , но также является частью клеточной биологии/цитологии (раздела анатомии человека), которая занимается тем, как хромосомы связаны с поведением клеток, в частности с их поведением во время митоза и мейоза . [1] Используемые методы включают кариотипирование , анализ хромосом с G-полосами , другие методы цитогенетических полос, а также молекулярную цитогенетику, такую как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и сравнительная геномная гибридизация (CGH).
Хромосомы были впервые обнаружены в растительных клетках Карлом Негели в 1842 году. Их поведение в клетках животных ( саламандры ) было описано Вальтером Флеммингом , первооткрывателем митоза , в 1882 году. Название было придумано другим немецким анатомом, фон Вальдейером, в 1888 году.
Следующий этап имел место после развития генетики в начале 20-го века, когда было признано, что набор хромосом ( кариотип ) является носителем генов. Левицкий, по-видимому, был первым, кто определил кариотип как фенотипический вид соматических хромосом , в отличие от их генного содержимого. [2] [3] Исследование человеческого кариотипа заняло много лет, чтобы решить самый простой вопрос: сколько хромосом содержит нормальная диплоидная клетка человека? [4] В 1912 году Ганс фон Винивартер сообщил о 47 хромосомах в сперматогониях и 48 в оогониях , сделав вывод о механизме определения пола XX/XO . [5] В 1922 году Пейнтер не был уверен, было ли диплоидное число людей 46 или 48, сначала отдавая предпочтение 46. [6] Позже он пересмотрел свое мнение с 46 на 48 и правильно настоял на том, что у людей есть система определения пола XX/XY . [7] Учитывая их методы, эти результаты были весьма примечательными. В научных книгах число человеческих хромосом оставалось равным 48 в течение более тридцати лет. Для исправления этой ошибки требовались новые методы. Джо Хин Тджио, работавший в лаборатории Альберта Левана [8] [9], был ответственным за поиск подхода:
Лишь в 1956 году было принято считать, что кариотип человека включает всего 46 хромосом. [10] [11] [12] У человекообразных обезьян 48 хромосом. Человеческая хромосома 2 образовалась в результате слияния предковых хромосом, что привело к сокращению их числа. [13]
Барбара МакКлинток начала свою карьеру в качестве цитогенетика кукурузы . В 1931 году МакКлинток и Харриет Крейтон продемонстрировали, что цитологическая рекомбинация маркированных хромосом коррелирует с рекомбинацией генетических признаков ( генов ). МакКлинток, работая в Институте Карнеги , продолжила предыдущие исследования механизмов разрыва хромосом и вспышки слияния у кукурузы. Она определила конкретное событие разрыва хромосомы, которое всегда происходило в одном и том же локусе на хромосоме 9 кукурузы, которое она назвала « Ds» или локусом «диссоциации». [14] МакКлинток продолжила свою карьеру в цитогенетике, изучая механику и наследование разорванных и кольцевых (круговых) хромосом кукурузы. Во время своей цитогенетической работы МакКлинток открыла транспозоны , открытие, которое в конечном итоге привело к ее Нобелевской премии в 1983 году.
В 1930-х годах Добжанский и его коллеги собрали Drosophila pseudoobscura и D. persimilis из диких популяций в Калифорнии и соседних штатах. Используя технику Пейнтера [15], они изучили политенные хромосомы и обнаружили, что дикие популяции были полиморфны по хромосомным инверсиям . Все мухи выглядят одинаково, какие бы инверсии они ни несли: это пример криптического полиморфизма. [ необходима цитата ]
Быстро накапливались доказательства того, что естественный отбор был ответственным. Используя метод, изобретенный Л'Эритье и Тейссье, Добжанский разводил популяции в популяционных клетках , что позволяло кормить, разводить и делать выборки, предотвращая при этом побег. Это имело преимущество в устранении миграции как возможного объяснения результатов. Популяции, содержащие инверсии с известной начальной частотой, можно поддерживать в контролируемых условиях. Было обнаружено, что различные типы хромосом не колеблются случайным образом, как это было бы, если бы они были селективно нейтральными, а подстраиваются под определенные частоты, при которых они стабилизируются. К тому времени, когда Добжанский опубликовал третье издание своей книги в 1951 году [16], он был убежден, что морфы хромосом поддерживались в популяции за счет селективного преимущества гетерозигот, как и в случае большинства полиморфизмов . [17] [18]
Лилия является предпочтительным организмом для цитологического исследования мейоза, поскольку хромосомы большие, и каждая морфологическая стадия мейоза может быть легко идентифицирована микроскопически. Хотта, Чандли и др. [19] представили доказательства общей схемы синтеза надрезов и репарации ДНК в мужских мейотических клетках лилий и грызунов на стадиях зиготены–пахитены мейоза, когда предполагалось, что происходит кроссинговер. Наличие общей схемы между такими филогенетически далекими организмами, как лилия и мышь, привело авторов к выводу, что организация мейотического кроссинговера, по крайней мере, у высших эукариот, вероятно, универсальна по распространению. [ необходима цитата ]
После появления процедур, которые позволили легко подсчитать хромосомы, быстро были сделаны открытия, связанные с аберрантными хромосомами или числом хромосом. [ необходима цитата ]
Конституциональная цитогенетика: При некоторых врожденных расстройствах, таких как синдром Дауна , цитогенетика выявила природу хромосомного дефекта: «простую» трисомию. Аномалии, возникающие в результате событий нерасхождения , могут вызывать клетки с анеуплоидией (добавления или делеции целых хромосом) у одного из родителей или у плода. В 1959 году Лежен [20] обнаружил, что у пациентов с синдромом Дауна есть дополнительная копия хромосомы 21. Синдром Дауна также называют трисомией 21.
Другие обнаруженные числовые аномалии включают аномалии половых хромосом. У самки только с одной Х-хромосомой наблюдается синдром Тернера , тогда как у самца с дополнительной Х-хромосомой, в результате чего общее количество хромосом составляет 47, наблюдается синдром Клайнфельтера . Многие другие комбинации половых хромосом совместимы с живорождением, включая XXX , XYY и XXXX. Способность млекопитающих переносить анеуплоидии в половых хромосомах возникает из-за способности инактивировать их , что требуется нормальным самкам для компенсации наличия двух копий хромосомы. Не все гены на Х-хромосоме инактивируются, поэтому у особей с дополнительными Х-хромосомами наблюдается фенотипический эффект. [ необходима цитата ]
Трисомия 13 была связана с синдромом Патау , а трисомия 18 — с синдромом Эдвардса . [ необходима ссылка ]
Приобретенная цитогенетика: В 1960 году Питер Ноуэлл и Дэвид Хангерфорд [21] обнаружили небольшую хромосому в лейкоцитах пациентов с хроническим миелоидным лейкозом (ХМЛ). Эта аномальная хромосома была названа Филадельфийской хромосомой , поскольку оба ученых проводили свои исследования в Филадельфии, штат Пенсильвания . Тринадцать лет спустя, с развитием более продвинутых методов, Джанет Роули показала, что аномальная хромосома является результатом транслокации хромосом 9 и 22. Идентификация Филадельфийской хромосомы цитогенетикой является диагностической для ХМЛ. Более 780 лейкозов и сотни солидных опухолей (легких, простаты, почек и т. д.) в настоящее время характеризуются приобретенной хромосомной аномалией, прогностическое значение которой имеет решающее значение. Идентификация этих хромосомных аномалий привела к открытию очень большого количества «генов рака» (или онкогенов ). Растущие знания об этих генах рака теперь позволяют разрабатывать таргетные терапии , которые преобразуют перспективы выживания пациентов. Таким образом, цитогенетика играла и продолжает играть существенную роль в прогрессе понимания рака. Большие базы данных ( Атлас генетики и цитогенетики в онкологии и гематологии , база данных рака COSMIC , база данных хромосомных аберраций и слияний генов при раке Mitelman ) позволяют исследователям и клиницистам иметь необходимый корпус для их работы в этой области.
В конце 1960-х годов Торбьёрн Касперссон разработал метод флуоресцентного окрашивания хинакрином (Q-бэндинг), который выявил уникальные паттерны полос для каждой пары хромосом. Это позволило дифференцировать пары хромосом одинакового размера по различным горизонтальным паттернам полос. Паттерны полос теперь используются для выяснения точек разрыва и составляющих хромосом, участвующих в хромосомных транслокациях . Делеции и инверсии в пределах отдельной хромосомы также могут быть идентифицированы и описаны более точно с использованием стандартизированной номенклатуры полос. G-бэндинг (с использованием трипсина и окраски Гимзы/Райта) был одновременно разработан в начале 1970-х годов и позволяет визуализировать паттерны полос с помощью микроскопа в светлом поле. [ необходима цитата ]
Диаграммы, идентифицирующие хромосомы на основе полосатых рисунков, известны как идиограммы . Эти карты стали основой для пренатальных и онкологических областей, чтобы быстро переместить цитогенетику в клиническую лабораторию, где кариотипирование позволило ученым искать хромосомные изменения. Методы были расширены, чтобы позволить культивировать свободные амниоциты , извлеченные из амниотической жидкости , и методы удлинения для всех типов культур, которые позволяют проводить полосатость с более высоким разрешением. [ необходима цитата ]
В 1980-х годах были достигнуты успехи в молекулярной цитогенетике . В то время как зонды, меченные радиоизотопами, гибридизовались с ДНК с 1969 года, теперь был сделан шаг в использовании зондов, меченных флуоресцентно. Их гибридизация с хромосомными препаратами с использованием существующих методов стала известна как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). [22] Это изменение значительно увеличило использование методов зондирования, поскольку зонды, меченные флуоресцентно, более безопасны. Дальнейшие достижения в микроманипуляциях и исследовании хромосом привели к технике микродиссекции хромосом , с помощью которой аберрации в структуре хромосом можно было изолировать, клонировать и изучать все более подробно. [ необходима цитата ]
Рутинный хромосомный анализ ( кариотипирование ) относится к анализу метафазных хромосом, которые были полосаты с использованием трипсина, а затем Гимзы , Лейшмана или смеси этих двух. Это создает уникальные узоры полос на хромосомах. Молекулярный механизм и причина этих узоров неизвестны, хотя они, вероятно, связаны с временем репликации и упаковкой хроматина. [ необходима цитата ]
В цитогенетических лабораториях используется несколько методов окрашивания хромосом. Квинакриновое окрашивание (Q-окрашивание) было первым методом окрашивания, использовавшимся для получения специфических рисунков полос. Этот метод требует флуоресцентного микроскопа и больше не используется так широко, как окрашивание по Гимзе (G-окрашивание). Обратное окрашивание, или R-окрашивание, требует тепловой обработки и меняет обычный черно-белый рисунок, который виден в G- и Q-полосах. Этот метод особенно полезен для окрашивания дистальных концов хромосом. Другие методы окрашивания включают C-окрашивание и окрашивание ядрышковых организующих областей (NOR-окрашивание). Эти последние методы специально окрашивают определенные части хромосомы. C-окрашивание окрашивает конститутивный гетерохроматин , который обычно находится вблизи центромеры, а NOR-окрашивание выделяет спутники и стебли акроцентрических хромосом . [ необходима цитата ]
Высокое разрешение бэндинга включает окрашивание хромосом во время профазы или ранней метафазы (прометафазы), до того, как они достигнут максимальной конденсации. Поскольку профазные и прометафазные хромосомы более протяженные, чем метафазные, количество полос, наблюдаемых для всех хромосом ( полос на гаплоидный набор , bph; «уровень полос»), увеличивается с примерно 300–450 до 800. Это позволяет обнаруживать менее очевидные аномалии, обычно не видимые при обычном бэндинге. [23]
Клетки из костного мозга , крови, амниотической жидкости, пуповинной крови , опухоли и тканей (включая кожу, пуповину , хорионические ворсины, печень и многие другие органы) можно культивировать с использованием стандартных методов культивирования клеток для увеличения их количества. Затем к культуре добавляют ингибитор митоза ( колхицин , колцемид ). Это останавливает деление клеток при митозе , что позволяет увеличить выход митотических клеток для анализа. Затем клетки центрифугируют, а среду и ингибитор митоза удаляют и заменяют гипотоническим раствором. Это заставляет лейкоциты или фибробласты набухать, так что хромосомы будут распространяться при добавлении на предметное стекло, а также лизирует эритроциты. После того, как клетки были оставлены в гипотоническом растворе, добавляют фиксатор Карнуа ( метанол с ледяной уксусной кислотой в соотношении 3:1 ). Это убивает клетки и затвердевает ядра оставшихся лейкоцитов. Клетки обычно фиксируются многократно, чтобы удалить любой дебрис или оставшиеся эритроциты. Затем суспензию клеток капают на предметные стекла. После выдерживания в печи или ожидания в течение нескольких дней они готовы к связыванию и анализу.
Анализ полосатых хромосом проводится под микроскопом специалистом клинической лаборатории по цитогенетике (CLSp(CG)). Обычно анализируется 20 клеток, что достаточно для исключения мозаицизма до приемлемого уровня. Результаты суммируются и передаются сертифицированному цитогенетику для проверки и написания интерпретации с учетом предыдущей истории болезни пациента и других клинических данных. Затем результаты выдаются в виде отчета в Международной системе цитогенетической номенклатуры человека 2009 г. (ISCN2009).
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) подразумевает использование флуоресцентно меченого зонда для гибридизации с цитогенетическими клеточными препаратами.
Помимо стандартных препаратов FISH также можно проводить на:
В этом разделе рассматривается приготовление стандартных цитогенетических препаратов.
Слайд выдерживают с использованием солевого раствора, обычно состоящего из 2X SSC (соль, цитрат натрия). Затем слайды дегидратируют в этаноле и добавляют смесь зонда. Затем образец ДНК и зонд ДНК совместно денатурируют с использованием нагретой пластины и дают им повторно отжигаться в течение как минимум 4 часов. Затем слайды промывают для удаления избытка несвязанного зонда и контрастно окрашивают 4',6-диамидино-2-фенилиндолом ( DAPI ) или пропидий иодидом.
Анализ образцов FISH выполняется с помощью флуоресцентной микроскопии специалистом клинической лаборатории по цитогенетике. В онкологии, как правило, подсчитывается большое количество интерфазных клеток, чтобы исключить низкоуровневое остаточное заболевание, обычно подсчитывается и оценивается от 200 до 1000 клеток. В случае врожденных проблем обычно оценивается 20 метафазных клеток. [ необходима цитата ]
В настоящее время достижения сосредоточены на молекулярной цитогенетике, включая автоматизированные системы для подсчета результатов стандартных препаратов FISH и методы виртуального кариотипирования , такие как массивы сравнительной геномной гибридизации, CGH и массивы полиморфизма отдельных нуклеотидов .