Гиперчувствительная реакция ( HR ) — это механизм, используемый растениями для предотвращения распространения инфекции микробными патогенами . HR характеризуется быстрой гибелью клеток в локальной области, окружающей инфекцию, и служит для ограничения роста и распространения патогенов в другие части растения. Она аналогична врожденной иммунной системе, обнаруженной у животных, и обычно предшествует более медленному системному (все растение) ответу, который в конечном итоге приводит к системной приобретенной устойчивости (SAR). [1] HR можно наблюдать у подавляющего большинства видов растений , и она вызывается широким спектром фитопатогенов , таких как оомицеты , вирусы , грибы и даже насекомые. [2]
HR обычно рассматривается как эффективная стратегия защиты от биотрофных фитопатогенов , которым для получения питательных веществ требуются живые ткани . В случае некротрофных патогенов HR может быть даже полезен для патогена , поскольку им требуются мертвые клетки растений для получения питательных веществ . Ситуация усложняется при рассмотрении таких патогенов, как Phytophthora infestans , которые на начальных стадиях заражения действуют как биотрофы, но позже переключаются на некротрофный образ жизни. Предполагается, что в этом случае HR может быть полезен на ранних стадиях заражения, но не на более поздних. [3]
Первая идея о том, как происходит реакция гиперчувствительности, пришла из модели ген-на-ген Гарольда Генри Флора . Он постулировал, что для каждого гена устойчивости (R), кодируемого растением, существует соответствующий ген авирулентности (Avr), кодируемый микробом . Растение устойчиво к патогену , если оба гена Avr и R присутствуют во взаимодействии растения с патогеном. [4] Гены , которые участвуют во взаимодействии растения с патогеном, как правило, развиваются очень быстро. [5]
Очень часто сопротивление, опосредованное генами R , обусловлено тем, что они вызывают HR, что приводит к апоптозу . Большинство генов R растений кодируют белки NOD-подобных рецепторов (NLR) . [6] Архитектура домена белка NLR состоит из домена NB-ARC, который является доменом связывания нуклеотидов , ответственным за конформационные изменения, связанные с активацией белка NLR . В неактивной форме домен NB-ARC связан с аденозиндифосфатом (АДФ). Когда обнаруживается патоген , АДФ обменивается на аденозинтрифосфат (АТФ), и это вызывает конформационное изменение в белке NLR , что приводит к HR. На N-конце NLR имеет либо домен рецептора Toll-Interleukin (TIR) (также обнаруженный в рецепторах Toll-подобных млекопитающих ), либо мотив спиральной спирали (CC). Оба домена TIR и CC участвуют в гибели клеток во время HR. C-конец NLR состоит из мотива повтора, богатого лейцином (LRR), который участвует в распознавании факторов вирулентности патогена . [7]
HR запускается растением, когда оно распознает патоген . Идентификация патогена обычно происходит, когда продукт гена вирулентности , секретируемый патогеном , связывается или косвенно взаимодействует с продуктом гена R растения . Гены R высокополиморфны , и многие растения производят несколько различных типов продуктов гена R , что позволяет им распознавать продукты вирулентности, производимые многими различными патогенами . [ 8]
В первой фазе HR активация генов R запускает поток ионов , включающий отток гидроксида и калия наружу из клеток и приток ионов кальция и водорода в клетки. [9]
На втором этапе клетки, участвующие в HR, генерируют окислительный взрыв , производя активные формы кислорода (ROS), супероксидные анионы , перекись водорода , гидроксильные радикалы и закись азота . Эти соединения влияют на функцию клеточной мембраны , частично вызывая перекисное окисление липидов и вызывая повреждение липидов. [9]
Изменение ионных компонентов в клетке и разрушение клеточных компонентов в присутствии ROS приводит к гибели пораженных клеток, а также к образованию локальных поражений . Активные формы кислорода также вызывают отложение лигнина и каллозы , а также сшивание предварительно сформированных гидроксипролин -богатых гликопротеинов, таких как P33, с матрицей стенки через тирозин в мотиве PPPPY. [9] Эти соединения служат для укрепления стенок клеток, окружающих инфекцию, создавая барьер и препятствуя распространению инфекции. [10] Активация HR также приводит к нарушению цитоскелета, митохондриальной функции и метаболическим изменениям, все из которых могут быть причастны к гибели клетки. [11] [12] [13]
HR может быть активирован двумя основными способами: напрямую и косвенно. Прямое связывание факторов вирулентности с NLR может привести к активации HR. Однако это, по-видимому, довольно редко. Чаще всего факторы вирулентности нацелены на определенные клеточные белки , которые они модифицируют, и эта модификация затем воспринимается NLR. Косвенное распознавание, по-видимому, более распространено, поскольку несколько факторов вирулентности могут модифицировать один и тот же клеточный белок с одинаковыми модификациями, таким образом, позволяя одному рецептору распознавать несколько факторов вирулентности . [14] Иногда домены белков, на которые нацелены факторы вирулентности , интегрированы в NLR. Пример этого можно наблюдать в устойчивости растений к патогену пирикуляриоза риса , где RGA5 NLR имеет домен, ассоциированный с тяжелыми металлами (HMA), интегрированный в его структуру, который нацелен на несколько эффекторных белков . [15]
Пример непрямого распознавания: AvrPphB — это эффекторный белок типа III, секретируемый Pseudomonas syringae . Это протеаза , которая расщепляет клеточную киназу PBS1. Модифицированная киназа распознается RPS5 NLR. [16]
Недавние структурные исследования белков CC-NLR предположили, что после обнаружения факторов вирулентности NLR собираются в пентамерную структуру, известную как резистосома. Резистосома, по-видимому, имеет высокое сродство к клеточной мембране . Когда резистосома собирается, спираль торчит из N-конца каждого NLR, и это создает пору в мембране, которая позволяет происходить утечке ионов , и, таким образом, клетка умирает . Однако этот механизм только выведен из структуры, и в настоящее время нет механистических исследований, подтверждающих это. До сих пор неизвестно, как активируются белки TIR-NLR. Недавние исследования показывают, что им требуются белки CC-NLR ниже по течению от них, которые затем активируются для формирования резистосом и вызывают HR. [17]
Известно, что NLR могут функционировать индивидуально, но есть также случаи, когда белки NLR работают парами. Пара состоит из сенсорного NLR и вспомогательного NLR. Сенсорный NLR отвечает за распознавание секретируемого патогеном эффекторного белка и активацию вспомогательного NLR, который затем выполняет клеточную смерть . Гены как сенсорного, так и соответствующего вспомогательного NLR обычно парные в геноме , и их экспрессия может контролироваться одним и тем же промотором . Это позволяет функциональной паре, а не отдельным компонентам, разделяться во время деления клетки , а также гарантирует, что в клетке производится равное количество обоих NLR. [18]
Пары рецепторов работают посредством двух основных механизмов: негативной регуляции или кооперации.
В сценарии негативной регуляции сенсорный NLR отвечает за негативную регуляцию хелперного NLR и предотвращение гибели клеток в нормальных условиях. Однако, когда эффекторный белок вводится и распознается сенсорным NLR, негативная регуляция хелперного NLR ослабевает и индуцируется HR. [19]
В механизмах кооперации, когда сенсорный NLR распознает эффекторный белок, он подает сигнал вспомогательному NLR, тем самым активируя его. [20]
Недавно было обнаружено, что в дополнение к действию в качестве одиночек или пар, NLR растений могут действовать в сетях. В этих сетях обычно много сенсорных NLR, парных с относительно небольшим количеством вспомогательных NLR. [20]
Одним из примеров белков, вовлеченных в сети NLR, являются те, которые принадлежат к суперкладу NRC. Кажется, что сети эволюционировали из события дупликации генетически связанной пары NLR в несвязанный локус, что позволило новой паре эволюционировать для реагирования на новый патоген . Такое разделение, кажется, обеспечивает пластичность системы, поскольку позволяет сенсорным NLR эволюционировать быстрее в ответ на быструю эволюцию эффекторов патогена , тогда как вспомогательный NLR может эволюционировать гораздо медленнее, чтобы сохранить свою способность вызывать HR. Однако кажется, что в ходе эволюции также эволюционировали новые вспомогательные NLR, предположительно, потому что определенные сенсорные NLR требуют определенных вспомогательных NLR для оптимального функционирования. [20]
Биоинформатический анализ NLR растений показал, что на N-конце вспомогательных NLRs имеется консервативный мотив MADA, но не сенсорных NLRs. Около 20% всех CC-NLRs имеют мотив MADA, что подразумевает важность мотива для выполнения HR. [21]
Случайная активация HR через белки NLR может вызвать обширное разрушение растительной ткани, поэтому NLR сохраняются в неактивной форме посредством жесткой отрицательной регуляции как на транскрипционном , так и на посттрансляционном уровнях. В нормальных условиях мРНК NLR транскрибируются на очень низких уровнях, что приводит к низким уровням белка в клетке. NLR также требуют значительного количества белков-шаперонов для их сворачивания. Неправильно свернутые белки немедленно убиквитинируются и разрушаются протеасомой . [ 22] Было замечено, что во многих случаях, если белки-шапероны, участвующие в биосинтезе NLR, выключаются , HR отменяется, а уровни NLR значительно снижаются. [23]
Внутримолекулярные взаимодействия также необходимы для регуляции HR. Белки NLR не линейны: домен NB-ARC зажат между доменами LRR и TIR / CC . В нормальных условиях в цитоплазме присутствует гораздо больше АТФ , чем АДФ , и такое расположение белков NLR предотвращает спонтанный обмен АДФ на АТФ и, таким образом, активацию HR. Только когда обнаруживается фактор вирулентности , АДФ обменивается на АТФ . [14]
Мутации в определенных компонентах защитного механизма растений приводят к активации HR без присутствия патогенных эффекторных белков . Некоторые из этих мутаций наблюдаются в генах NLR и приводят к тому, что эти белки NLR становятся аутоактивными из-за нарушенных внутримолекулярных регуляторных механизмов. Другие мутации, вызывающие спонтанную HR, присутствуют в белках, участвующих в производстве ROS во время вторжения патогена . [3]
HR также является температурно-чувствительным процессом, и было замечено, что во многих случаях взаимодействия растений и патогенов не вызывают HR при температурах выше 30 °C, что впоследствии приводит к повышенной восприимчивости к патогену . [24] Механизмы, лежащие в основе влияния температуры на устойчивость растений к патогенам, детально не изучены, однако исследования показывают, что уровни белка NLR могут быть важны в этой регуляции. [25] Также предполагается, что при более высоких температурах белки NLR с меньшей вероятностью образуют олигомерные комплексы , тем самым подавляя их способность вызывать HR. [26]
Также было показано, что HR зависит от условий освещения, что может быть связано с активностью хлоропластов и, главным образом, с их способностью генерировать ROS . [27]
Было показано, что несколько ферментов участвуют в образовании ROS . Например, медная аминоксидаза катализирует окислительное дезаминирование полиаминов , особенно путресцина , и высвобождает медиаторы ROS — перекись водорода и аммиак . [28] Другие ферменты , которые , как считается , играют роль в образовании ROS , включают ксантиноксидазу , НАДФН-оксидазу , оксалатоксидазу , пероксидазы и флавинсодержащие аминоксидазы. [9]
В некоторых случаях клетки, окружающие поражение, синтезируют антимикробные соединения, включая фенолы , фитоалексины и белки , связанные с патогенезом (PR) , включая β-глюканазы и хитиназы . Эти соединения могут действовать, прокалывая стенки бактериальных клеток ; или задерживая созревание, нарушая метаболизм или предотвращая размножение рассматриваемого патогена .
Исследования показали, что фактический режим и последовательность демонтажа клеточных компонентов растений зависят от каждого отдельного взаимодействия растения и патогена, но все HR, по-видимому, требуют участия цистеиновых протеаз . Индукция гибели клеток и очистка от патогенов также требуют активного синтеза белка , неповрежденного актинового цитоскелета и присутствия салициловой кислоты . [8]
Патогены выработали несколько стратегий для подавления защитных реакций растений. Процессы хозяина, на которые обычно нацелены бактерии, включают: изменения запрограммированных путей гибели клеток , ингибирование защиты на основе клеточной стенки и изменение сигнализации гормонов растений и экспрессии защитных генов . [29]
Было показано , что локальная инициация HR в ответ на определенные некротрофные патогены позволяет растениям вырабатывать системный иммунитет против патогена . [30] Ученые пытались использовать способность HR вызывать системную устойчивость у растений, чтобы создать трансгенные растения, устойчивые к определенным патогенам . Индуцируемые патогеном промоторы были связаны с аутоактивными генами NLR , чтобы вызывать реакцию HR только при наличии патогена , но не в любое другое время. Однако этот подход оказался в основном неосуществимым, поскольку модификация также приводит к существенному снижению урожайности растений. [3]
Было замечено, что у Arabidopsis иногда при скрещивании двух разных линий растений потомство проявляет признаки гибридного некроза . Это происходит из-за того, что родительские растения содержат несовместимые NLR, которые при совместной экспрессии в одной клетке вызывают спонтанный HR. [31]
Это наблюдение породило гипотезу о том, что фитопатогены могут приводить к видообразованию растений — если популяции растений одного вида развивают несовместимые NLR в ответ на различные эффекторы патогенов , это может привести к гибридному некрозу у потомства F1 , что существенно снижает приспособленность потомства и поток генов к последующим поколениям. [32]
И растения, и животные имеют белки NLR , которые, по-видимому, имеют одну и ту же биологическую функцию – вызывать гибель клеток . N-концы NLR растений и животных различаются, но, по-видимому, оба имеют домены LRR на C-конце. [33]
Большое различие между NLR животных и растений заключается в том, что они распознают. NLR животных в основном распознают молекулярные паттерны, ассоциированные с патогенами (PAMPs), в то время как NLR растений в основном распознают белки-эффекторы патогенов . Это имеет смысл, поскольку NLR присутствуют внутри клетки , а растения редко имеют внутриклеточные патогены , за исключением вирусов , а вирусы не имеют PAMPs , поскольку они быстро эволюционируют. С другой стороны, у животных есть внутриклеточные патогены . [34]
Подавляющее большинство растительных линий, за исключением некоторых водорослей , таких как Chlamydomonas , имеют NLR. NLR также присутствуют у многих видов животных , однако, они отсутствуют, например, у Drosophila melanogaster и Arthropods . [33]
При распознавании PAMP NLR у животных NLR олигомеризуются , образуя структуру, известную как инфламмасома , которая активирует пироптоз . В растениях структурные исследования показали, что NLR также олигомеризуются , образуя структуру, называемую резистосомой, которая также приводит к гибели клеток . Кажется, что как у растений, так и у животных образование резистосомы или инфламмасомы , соответственно, приводит к гибели клеток за счет образования пор в мембране . Из структур белков следует , что у растений сами NLR ответственны за образование пор в мембране , в то время как в случае инфламмасомы порообразующая активность возникает из-за гасдермина D , который расщепляется каспазами в результате олигомеризации NLR . [35] [36] Растительные клетки не имеют каспаз . [37]