Термины «гликаны» и «полисахариды» определены ИЮПАК как синонимы, означающие «соединения, состоящие из большого количества моносахаридов, связанных гликозидно». [1] Однако на практике термин «гликан» также может использоваться для обозначения углеводной части гликоконъюгата , такой как гликопротеин , гликолипид или протеогликан , даже если углевод представляет собой только олигосахарид . [2] Гликаны обычно состоят исключительно из О-гликозидных связей моносахаридов. Например, целлюлоза представляет собой гликан (или, точнее, глюкан ), состоящий из β-1,4-связанной D -глюкозы, а хитин представляет собой гликан, состоящий из β-1,4-связанной N -ацетил- D. -глюкозамин. Гликаны могут представлять собой гомо- или гетерополимеры остатков моносахаридов и могут быть линейными или разветвленными.
Гликаны могут быть прикреплены к белкам, как в гликопротеинах, так и в протеогликанах. Как правило, они находятся на внешней поверхности клеток. О- и N-связанные гликаны очень распространены у эукариот , но также могут быть обнаружены, хотя и реже, у прокариот .
N-связанные гликаны присоединяются в эндоплазматическом ретикулуме к азоту (N) в боковой цепи аспарагина (Asn) в секвоне . Секвен представляет собой последовательность Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, где X представляет собой любую аминокислоту, кроме пролина , а гликан может состоять из N- ацетилгалактозамина , галактозы , нейраминовой кислоты , N -ацетилглюкозамина , фукозы , маннозы и другие моносахариды.
У эукариот N-связанные гликаны происходят из основной 14- сахарной единицы, собранной в цитоплазме и эндоплазматическом ретикулуме . Во-первых, два остатка N- ацетилглюкозамина присоединяются к долихолмонофосфату , липиду, на внешней стороне мембраны эндоплазматического ретикулума. Затем к этой структуре добавляются пять остатков маннозы. В этот момент частично готовый коровый гликан переворачивается через мембрану эндоплазматического ретикулума и теперь располагается внутри просвета ретикулярной сети. Затем сборка продолжается в эндоплазматическом ретикулуме с добавлением еще четырех остатков маннозы. Наконец, к этой структуре добавляются три остатка глюкозы. После полной сборки гликан переносится целиком гликозилтрансферазой - олигосахарилтрансферазой в формирующуюся пептидную цепь внутри ретикулярного просвета. Таким образом, эта основная структура N-связанных гликанов состоит из 14 остатков (3 глюкозы, 9 маннозы и 2 N -ацетилглюкозамина).
Изображение: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=глико.figgrp.469.
Темные квадраты — N -ацетилглюкозамин; светлые кружочки — манноза; темные треугольники — глюкоза.
После переноса в формирующуюся пептидную цепь N-связанные гликаны, как правило, подвергаются обширным реакциям процессинга, в результате которых удаляются три остатка глюкозы, а также несколько остатков маннозы, в зависимости от рассматриваемого N-связанного гликана. Удаление остатков глюкозы зависит от правильного сворачивания белка. Эти реакции обработки происходят в аппарате Гольджи . Реакции модификации могут включать добавление фосфатной или ацетильной группы к сахарам или добавление новых сахаров, таких как нейраминовая кислота . Процессинг и модификация N-связанных гликанов в аппарате Гольджи не идет по линейному пути. В результате возможно множество различных вариантов структуры N-связанных гликанов в зависимости от активности ферментов в аппарате Гольджи.
N-связанные гликаны чрезвычайно важны для правильного сворачивания белков в эукариотических клетках. Белки -шапероны эндоплазматического ретикулума, такие как кальнексин и кальретикулин , связываются с тремя остатками глюкозы, присутствующими в ядре N-связанного гликана. Эти белки-шапероны затем помогают сворачивать белок, к которому прикреплен гликан. После правильного сворачивания три остатка глюкозы удаляются, и гликан переходит к дальнейшим реакциям обработки. Если белок не сворачивается должным образом, три остатка глюкозы повторно присоединяются, позволяя белку повторно ассоциироваться с шаперонами. Этот цикл может повторяться несколько раз, пока белок не достигнет правильной конформации. Если белку неоднократно не удается правильно свернуть, он выводится из эндоплазматической сети и разрушается цитоплазматическими протеазами.
N-связанные гликаны также способствуют сворачиванию белков за счет стерических эффектов. Например, остатки цистеина в пептиде могут быть временно заблокированы от образования дисульфидных связей с другими остатками цистеина из-за размера близлежащего гликана. Следовательно, наличие N-связанного гликана позволяет клетке контролировать, какие остатки цистеина будут образовывать дисульфидные связи.
N-связанные гликаны также играют важную роль во межклеточных взаимодействиях. Например, опухолевые клетки вырабатывают аномальные N-связанные гликаны. Они распознаются рецептором CD337 на клетках естественных киллеров как признак того, что рассматриваемая клетка является раковой.
В иммунной системе N-связанные гликаны на поверхности иммунных клеток помогают определить характер миграции клетки, например, иммунные клетки, которые мигрируют в кожу, имеют специфические гликозилирования, способствующие возвращению в этот участок. [3] Паттерны гликозилирования различных иммуноглобулинов, включая IgE, IgM, IgD, IgE, IgA и IgG, наделяют их уникальными эффекторными функциями, изменяя их сродство к Fc и другим иммунным рецепторам. [3] Гликаны также могут участвовать в различении «своих» и «чужих», что может иметь отношение к патофизиологии различных аутоиммунных заболеваний; [3] включая ревматоидный артрит [4] и диабет 1 типа. [5]
Нацеливание на деградирующие лизосомальные ферменты также осуществляется с помощью N-связанных гликанов. Модификация N-связанного гликана остатком маннозо-6-фосфата служит сигналом о том, что белок, к которому присоединен этот гликан, должен быть перемещен в лизосому. Это распознавание и транспортировка лизосомальных ферментов в присутствии маннозо-6-фосфата осуществляется двумя белками: CI-MPR (катиононезависимый маннозо-6-фосфатный рецептор ) и CD-MPR (катионозависимый маннозо-6-фосфатный рецептор). ).
У эукариот О -связанные гликаны собираются по одному сахару на остатке серина или треонина пептидной цепи в аппарате Гольджи. В отличие от N -связанных гликанов, пока не существует известной консенсусной последовательности . Однако размещение остатка пролина в положении -1 или +3 относительно серина или треонина благоприятно для О-связанного гликозилирования.
Первым моносахаридом, присоединяемым при синтезе О -связанных гликанов, является N-ацетилгалактозамин. После этого возможны несколько разных путей. Структура Core 1 создается за счет добавления галактозы. Структура Core 2 создается путем добавления N-ацетилглюкозамина к N-ацетилгалактозамину структуры Core 1. Структуры ядра 3 образуются путем добавления одного N-ацетилглюкозамина к исходному N-ацетилгалактозамину. Структуры Core 4 образуются путем добавления второго N-ацетилглюкозамина к структуре Core 3. Возможны и другие основные структуры, хотя и менее распространенные.
Изображений:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=глико.figgrp.561: поколение Core 1 и Core 2. Белый квадрат = N-ацетилгалактозамин; черный кружок = галактоза; Черный квадрат = N-ацетилглюкозамин. Примечание. На этой схеме допущена ошибка. Нижний квадрат на каждом изображении всегда должен быть белым, а не черным.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=глико.figgrp.562: поколения Core 3 и Core 4.
Общей структурной темой О-связанных гликанов является добавление полилактозаминовых единиц к различным основным структурам. Они образуются в результате повторяющегося добавления единиц галактозы и N-ацетилглюкозамина. Цепи полилактозамина на О-связанных гликанах часто замыкаются за счет добавления остатка сиаловой кислоты (аналогично нейраминовой кислоте). Если к предпоследнему остатку также добавляется остаток фукозы , образуется структура сиалила-Льюиса X (SLex).
Сиалил Льюиса x важен для определения антигена крови ABO .
SLex также важен для правильного иммунного ответа. Высвобождение P- селектина из телец Вейбеля-Паладе на эндотелиальных клетках кровеносных сосудов может быть индуцировано рядом факторов. Одним из таких факторов является реакция эндотелиальной клетки на определенные бактериальные молекулы, такие как пептидогликан . P-селектин связывается со структурой SLex, которая присутствует на нейтрофилах в кровотоке , и помогает опосредовать экстравазацию этих клеток в окружающие ткани во время инфекции.
Было обнаружено, что О -связанные гликаны, в частности муцин , играют важную роль в развитии нормальной микрофлоры кишечника. Определенные штаммы кишечных бактерий специфически связываются с муцином, что позволяет им колонизировать кишечник.
Примерами O -связанных гликопротеинов являются:
Другим типом клеточных гликанов являются гликозаминогликаны (ГАГ). Они включают 2-аминосахара, поочередно связанные с уроновыми кислотами , и включают такие полимеры, как гепарин , гепарансульфат , хондроитин , кератан и дерматан . Некоторые гликозаминогликаны, такие как гепарансульфат, обнаруживаются прикрепленными к поверхности клетки, где они связываются через тетрасахаридный линкер через ксилозильный остаток с белком (образуя гликопротеин или протеогликан ).
В докладе Национального исследовательского совета США за 2012 год содержится призыв к новому акценту на гликонауке — области, которая исследует структуры и функции гликанов и обещает большие достижения в таких разнообразных областях, как медицина, производство энергии и материаловедение. [6] До сих пор гликанам уделялось мало внимания со стороны исследовательского сообщества из-за отсутствия инструментов для исследования их зачастую сложных структур и свойств. [7] В докладе представлена дорожная карта по преобразованию гликонауки из области, в которой доминируют специалисты, в широко изучаемую и интегрированную дисциплину.
См. гликолипиды.
Ниже приведены примеры широко используемых методов анализа гликанов: [8] [9]
Наиболее часто применяемыми методами являются МС и ВЭЖХ , в которых гликановая часть ферментативно или химически отщепляется от мишени и подвергается анализу. [10] В случае гликолипидов их можно анализировать напрямую, без разделения липидного компонента.
N- гликаны гликопротеинов обычно анализируются с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (обратно-фазовая, нормальная фаза и ионообменная ВЭЖХ) после мечения восстанавливающего конца сахаров флуоресцентным соединением (восстановительное мечение). [11] В последние годы было введено большое количество различных меток, в том числе 2-аминобензамид (AB), антраниловая кислота (AA), 2-аминопиридин (PA), 2-аминоакридон (AMAC) и 3-(ацетиламино)- 6-аминоакридин (AA-Ac) – лишь некоторые из них. [12] Для разных режимов ESI и используемых систем MS необходимо использовать разные метки. [13]
О- гликаны обычно анализируются без каких-либо меток, поскольку условия химического высвобождения не позволяют их маркировать.
Фракционированные гликаны из приборов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) можно дополнительно проанализировать с помощью MALDI -TOF-MS(MS) для получения дополнительной информации о структуре и чистоте. Иногда пулы гликанов анализируются непосредственно с помощью масс-спектрометрии без предварительного фракционирования, хотя различение изобарных гликановых структур является более сложным или даже не всегда возможным. В любом случае, прямой анализ MALDI -TOF-MS может привести к быстрой и простой иллюстрации пула гликанов. [14]
В последние годы очень популярной стала онлайн-высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией. Выбрав пористый графитовый углерод в качестве неподвижной фазы для жидкостной хроматографии, можно анализировать даже непроизводные гликаны. Обнаружение здесь осуществляется с помощью масс-спектрометрии, но вместо MALDI -MS чаще используется ионизация электрораспылением ( ESI ). [15] [16] [17]
Хотя MRM широко используется в метаболомике и протеомике, ее высокая чувствительность и линейный отклик в широком динамическом диапазоне делают ее особенно подходящей для исследований и открытий гликановых биомаркеров. MRM выполняется на приборе тройного квадруполя (QqQ), который настроен на обнаружение заранее определенного иона-предшественника в первом квадруполе, фрагментированного при столкновении квадруполе и заранее определенного фрагментного иона в третьем квадруполе. Это метод без сканирования, в котором каждый переход обнаруживается индивидуально, а обнаружение нескольких переходов происходит одновременно в рабочих циклах. Этот метод используется для характеристики иммунного гликома. [3] [18]
Таблица 1 : Преимущества и недостатки масс-спектрометрии при анализе гликанов
Массивы лектинов и антител обеспечивают высокопроизводительный скрининг многих образцов, содержащих гликаны. В этом методе используются либо природные лектины, либо искусственные моноклональные антитела , причем оба они иммобилизуются на определенном чипе и инкубируются с образцом флуоресцентного гликопротеина.
Гликановые массивы, подобные предлагаемым Консорциумом функциональной гликомики и Z Biotech LLC, содержат углеводные соединения, которые можно проверять с помощью лектинов или антител для определения специфичности углеводов и идентификации лигандов.
Метаболическое мечение гликанов можно использовать как способ обнаружения гликановых структур. Хорошо известная стратегия включает использование меченных азидом сахаров, которые можно вводить в реакцию с помощью лигирования Штаудингера . Этот метод использовался для визуализации гликанов in vitro и in vivo.
Рентгеновская кристаллография и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для полного структурного анализа сложных гликанов являются трудной и сложной областью. Однако структура сайта связывания многочисленных лектинов , ферментов и других углеводсвязывающих белков выявила широкое разнообразие структурных основ функции гликома. Чистота тестируемых образцов была получена с помощью хроматографии ( аффинная хроматография и т. д.) и аналитического электрофореза ( ПААГ (электрофорез полиакриламида) , капиллярный электрофорез , аффинный электрофорез и т. д.).