В молекулярной биологии млекопитающих деметилирование ДНК вызывает замену 5-метилцитозина (5mC) в последовательности ДНК цитозином ( C) (см. рисунок 5mC и C). Деметилирование ДНК может происходить в результате активного процесса на участке 5mC в последовательности ДНК или, в реплицирующихся клетках, путем предотвращения добавления метильных групп к ДНК, так что реплицированная ДНК будет в основном иметь цитозин в последовательности ДНК (5mC будет разбавлен).
Метилированный цитозин часто присутствует в линейной последовательности ДНК , где за цитозином следует гуанин в направлении 5' → 3' ( сайт CpG ). У млекопитающих ДНК-метилтрансферазы (которые добавляют метильные группы к основаниям ДНК) демонстрируют сильное предпочтение последовательности цитозинов в сайтах CpG . [1] По-видимому, в геноме человека содержится более 20 миллионов динуклеотидов CpG (см. геномное распределение ). У млекопитающих в среднем 70–80 % цитозинов CpG метилированы, [2] хотя уровень метилирования варьируется в зависимости от разных тканей. Метилированные цитозины часто встречаются группами или островками CpG в промоторных областях генов , где такое метилирование может снизить или подавить экспрессию генов (см. экспрессия генов ). Однако метилированные цитозины в теле гена положительно коррелируют с экспрессией. [3]
Почти 100% деметилирование ДНК происходит путем комбинации пассивного разбавления и активного ферментативного удаления во время перепрограммирования , которое происходит в раннем эмбриогенезе и в гаметогенезе . Другое крупное деметилирование, около 3% всех генов, может происходить путем активного деметилирования в нейронах во время формирования сильной памяти. [4] После операции деметилирование обнаруживается в мононуклеарных клетках периферической крови в местах, аннотированных к генам иммунной системы. [5] Деметилирование также происходит во время образования раковых опухолей. [6] Во время глобального гипометилирования ДНК опухолевых геномов наблюдается незначительное или умеренное снижение количества метилированных цитозинов (5mC), что составляет потерю в среднем около 5% - 20% оснований 5mC. [7]
Геном сперматозоида мыши на 80–90% метилирован в участках CpG в ДНК, что составляет около 20 миллионов метилированных участков. [ необходима ссылка ] После оплодотворения отцовская хромосома почти полностью деметилируется в течение шести часов в результате активного процесса перед репликацией ДНК (синяя линия на рисунке).
Деметилирование материнского генома происходит другим процессом. В зрелом ооците около 40% его участков CpG в ДНК метилированы. В то время как соматические клетки млекопитающих имеют три основные ДНК-метилтрансферазы (которые добавляют метильные группы к цитозинам на участках CpG), DNMT1 , DNMT3A и DNMT3B , в эмбрионе до имплантации и до стадии бластоцисты (см. рисунок) единственная присутствующая метилтрансфераза — это изоформа DNMT1, обозначенная DNMT1o. [8] DNMT1o имеет альтернативный специфичный для ооцитов промотор и первый экзон (экзон 1o), расположенный 5' от соматических и сперматоцитарных промоторов. Как было рассмотрено Хауэллом и соавторами [8] , DNMT1o секвестрируется в цитоплазме зрелых ооцитов и в 2-клеточных и 4-клеточных эмбрионах, но на стадии 8 клеток присутствует только в ядре. На стадии 16 клеток (морула ) DNMT1o снова обнаруживается только в цитоплазме. Похоже, что деметилирование материнских хромосом в основном происходит путем блокирования метилирующего фермента DNMT1o от входа в ядро, за исключением короткого периода на стадии 8 клеток. Таким образом, ДНК материнского происхождения подвергается пассивному деметилированию путем разбавления метилированной материнской ДНК во время репликации (красная линия на рисунке). Морула ( на стадии 16 клеток) имеет лишь небольшое количество метилированной ДНК (черная линия на рисунке).
DNMT3b начинает экспрессироваться в бластоцисте. [9] Метилирование начинает увеличиваться на 3,5 день после оплодотворения в бластоцисте , а затем большая волна метилирования происходит на 4,5–5,5 день в эпибласте , увеличиваясь от 12% до 62% метилирования и достигая максимального уровня после имплантации в матку. [10] К седьмому дню после оплодотворения вновь образованные примордиальные половые клетки (ПЗК) в имплантированном эмбрионе отделяются от оставшихся соматических клеток . В этот момент ПЗК имеют примерно такой же уровень метилирования, как и соматические клетки.
Вновь образованные примордиальные половые клетки (ППК) в имплантированном эмбрионе происходят от соматических клеток. На этом этапе ППК имеют высокий уровень метилирования. Эти клетки мигрируют из эпибласта в сторону гонадного гребня . Как было рассмотрено Мессершмидтом и др. [11] , большинство ППК останавливаются в фазе G2 клеточного цикла, в то время как они мигрируют в сторону задней кишки в течение эмбриональных дней 7,5–8,5. Затем деметилирование ППК происходит двумя волнами. [11] На 9,5-й день первичные половые клетки начинают быстро реплицироваться, начиная примерно с 200 ППК на 9,5-й день эмбриона до примерно 10 000 ППК на 12,5-й день. [12] В течение 9,5–12,5 дней DNMT3a и DNMT3b подавляются, а DNMT1 присутствует в ядре на высоком уровне. Но DNMT1 не может метилировать цитозины в течение 9,5–12,5 дней, поскольку ген UHRF1 (также известный как NP95 ) подавляется, а UHRF1 является необходимым белком, необходимым для привлечения DNMT1 в очаги репликации, где происходит поддерживающее метилирование ДНК. [12] Это пассивная, разбавляющая форма деметилирования.
Кроме того, с 9,5 по 13,5 день эмбриона происходит активная форма деметилирования. Как указано ниже в разделе «Молекулярные стадии активного перепрограммирования», два фермента играют центральную роль в активном деметилировании. Это 10-11 транслокационная метилцитозиндиоксигеназа (TET) и тимин-ДНК-гликозилаза (TDG). Один конкретный фермент TET, TET1 и TDG, присутствуют на высоком уровне с 9,5 по 13,5 день эмбриона [12] и используются в активном деметилировании во время гаметогенеза. [11] Геномы PGC демонстрируют самые низкие уровни метилирования ДНК среди всех клеток за весь жизненный цикл мыши на 13,5 день эмбриона. [13]
Обучение и память имеют уровни постоянства, отличающиеся от других психических процессов, таких как мышление, язык и сознание, которые являются временными по своей природе. Обучение и память могут накапливаться либо медленно (таблицы умножения), либо быстро (прикосновение к горячей плите), но однажды достигнутые, могут быть вызваны для сознательного использования в течение длительного времени. Крысы, подвергнутые одному случаю контекстного условного рефлекса страха, создают особенно сильную долговременную память. Через 24 часа после обучения было обнаружено, что 9,17% генов в геномах нейронов гиппокампа крысы были дифференциально метилированы . Это включало более 2000 дифференциально метилированных генов через 24 часа после обучения, причем более 500 генов были деметилированы. [4] Аналогичные результаты, полученные в гиппокампе крысы, были получены и у мышей с контекстным условным рефлексом страха. [14]
Область гиппокампа мозга — это место, где сначала хранятся контекстные воспоминания о страхе (см. рисунок мозга в этом разделе), но это хранение является временным и не остается в гиппокампе. У крыс контекстное условное выражение страха отменяется, когда гиппокамп подвергается гиппокампэктомии всего через день после обусловливания, но крысы сохраняют значительное количество контекстного страха, когда гиппокампэктомия откладывается на четыре недели. [15] У мышей, обследованных через 4 недели после обусловливания, метилирование и деметилирование гиппокампа были обращены вспять (гиппокамп необходим для формирования воспоминаний, но воспоминания там не хранятся), в то время как существенное дифференциальное метилирование и деметилирование CpG произошло в корковых нейронах во время поддержания памяти. В передней поясной коре мышей через четыре недели после контекстного условного выражения страха было 1223 дифференциально метилированных гена. Таким образом, хотя вскоре после формирования памяти в гиппокампе наблюдалось множество метилирований, все эти метилирования в гиппокампе были деметилированы уже через четыре недели.
Геном человека содержит около 28 миллионов сайтов CpG, и примерно 60% сайтов CpG метилированы в 5-й позиции цитозина. [16] При образовании рака наблюдается среднее снижение количества метилированных цитозинов примерно на 5–20% [17] или примерно на 840 000–3,4 миллиона деметилирований сайтов CpG.
DNMT1 метилирует CpG на полуметилированной ДНК во время репликации ДНК. Таким образом, когда цепь ДНК имеет метилированный CpG, а вновь реплицированная цепь во время полуконсервативной репликации не имеет метильной группы на комплементарном CpG, DNMT1 обычно рекрутируется на полуметилированный сайт и добавляет метильную группу к цитозину во вновь синтезированном CpG. Однако рекрутирование DNMT1 на полуметилированные сайты CpG во время репликации ДНК зависит от белка UHRF1 . Если UHRF1 не связывается с полуметилированным сайтом CpG, то DNMT1 не рекрутируется и не может метилировать вновь синтезированный сайт CpG. Аргининметилтрансфераза PRMT6 регулирует метилирование ДНК, метилируя аргинин в положении 2 гистона 3 (H3R2me2a). [18] (См. Метилирование белка#Аргинин .) В присутствии H3R2me2a UHRF1 не может связываться с полуметилированным сайтом CpG, и тогда DNMT1 не привлекается к сайту, и сайт остается полуметилированным. При дальнейших раундах репликации метилированный CpG пассивно разбавляется. PRMT6 часто сверхэкспрессируется во многих типах раковых клеток. [19] Сверхэкспрессия PRMT6 может быть источником деметилирования ДНК при раке.
Для активного ферментативного перепрограммирования метилома ДНК требуются три молекулярные стадии . Стадия 1: Набор. Ферменты, необходимые для перепрограммирования, набираются в участки генома, требующие деметилирования или метилирования. Стадия 2: Реализация. Происходят начальные ферментативные реакции. В случае метилирования это короткий шаг, который приводит к метилированию цитозина в 5-метилцитозин. Стадия 3: Репарация ДНК с вырезанием оснований. Промежуточные продукты деметилирования катализируются специфическими ферментами пути репарации ДНК с вырезанием оснований, которые в конечном итоге восстанавливают цистозин в последовательности ДНК.
Деметилирование 5-метилцитозина для получения 5-гидроксиметилцитозина (5hmC) очень часто изначально включает окисление 5mC (см. Рисунок в этом разделе) метилцитозиндиоксигеназами транслокации ten-eleven ( ферментами TET ). [21] Молекулярные этапы этого начального деметилирования подробно показаны в ферментах TET . На последовательных этапах (см. Рисунок) ферменты TET дополнительно гидроксилируют 5hmC для получения 5-формилцитозина (5fC) и 5-карбоксилцитозина (5caC). Тимин-ДНК-гликозилаза (TDG) распознает промежуточные основания 5fC и 5caC и вырезает гликозидную связь, в результате чего образуется апиримидиновый сайт (сайт AP). За этим следует репарация эксцизии основания (этап 3). В альтернативном пути окислительного дезаминирования 5hmC может быть окислительно дезаминирован дезаминазами APOBEC (AID/APOBEC) с образованием 5-гидроксиметилурацила (5hmU). Также 5mC может быть преобразован в тимин (Thy). 5hmU может быть расщеплен TDG, MBD4 , NEIL1 или SMUG1 . Затем сайты AP и несоответствия T:G восстанавливаются ферментами репарации эксцизии оснований (BER) с получением цитозина (Cyt). Семейство диоксигеназ TET используется в наиболее частом типе реакций деметилирования. [21]
Изоформы диоксигеназы TET включают по крайней мере две изоформы TET1, одну TET2 и три изоформы TET3. [22] [23] Полноразмерная каноническая изоформа TET1, по-видимому, фактически ограничена ранними эмбрионами, эмбриональными стволовыми клетками и первичными половыми клетками (PGCs). Доминирующая изоформа TET1 в большинстве соматических тканей, по крайней мере у мыши, возникает из-за использования альтернативного промотора, который приводит к короткому транскрипту и укороченному белку, обозначенному TET1s. Изоформы TET3 представляют собой полноразмерную форму TET3FL, короткую форму сплайс-варианта TET3s и форму, которая встречается в ооцитах и нейронах, обозначенную TET3o. TET3o создается путем использования альтернативного промотора и содержит дополнительный первый N-концевой экзон, кодирующий 11 аминокислот. TET3o встречается только в ооцитах и нейронах и не экспрессируется в эмбриональных стволовых клетках или в любом другом типе клеток или взрослой мышиной ткани, которая была протестирована. В то время как экспрессия TET1 едва обнаруживается в ооцитах и зиготах, а TET2 экспрессируется лишь умеренно, вариант TET3 TET3o демонстрирует чрезвычайно высокие уровни экспрессии в ооцитах и зиготах, но почти отсутствует на стадии 2 клеток. Возможно, что TET3o, высокий в нейронах, ооцитах и зиготах на стадии одной клетки, является основным ферментом TET, используемым, когда в этих клетках происходят очень масштабные быстрые деметилирования.
Ферменты TET не связываются специфически с 5-метилцитозином , за исключением случаев рекрутирования. Без рекрутирования или нацеливания TET1 преимущественно связывается с промоторами CG с высоким содержанием CG и островками CpG (CGI) по всему геному с помощью своего домена CXXC, который может распознавать неметилированные CGI. [24] TET2 не имеет сродства к 5-метилцитозину в ДНК. [25] Домен CXXC полноразмерного TET3, который является преобладающей формой, экспрессируемой в нейронах, наиболее прочно связывается с CpG, где C был преобразован в 5-карбоксицитозин (5caC). Однако он также связывается с неметилированными CpG . [23]
Для того, чтобы фермент TET инициировал деметилирование, он должен сначала быть привлечен к метилированному сайту CpG в ДНК. Два из белков, которые, как показано, привлекают фермент TET к метилированному цитозину в ДНК, — это OGG1 (см. рисунок Инициирование деметилирования ДНК на сайте CpG) [26] и EGR1 . [27]
Оксогуанингликозилаза (OGG1) катализирует первый шаг в восстановлении эксцизионной основы окислительно поврежденного основания 8-OHdG . OGG1 находит 8-OHdG, скользя вдоль линейной ДНК на расстоянии 1000 пар оснований ДНК за 0,1 секунды. [28] OGG1 очень быстро находит 8-OHdG. Белки OGG1 связываются с окислительно поврежденной ДНК со временем полумаксимума около 6 секунд. [29] Когда OGG1 находит 8-OHdG, он меняет конформацию и образует комплексы с 8-OHdG в своем связывающем кармане. [30] OGG1 не сразу действует, чтобы удалить 8-OHdG. Половина максимального удаления 8-OHdG занимает около 30 минут в клетках HeLa in vitro , [31] или около 11 минут в печени облученных мышей. [32] Окисление ДНК активными формами кислорода преимущественно происходит в гуанине в метилированном сайте CpG из-за пониженного потенциала ионизации оснований гуанина, смежных с 5-метилцитозином. [33] TET1 связывается (привлекается) к OGG1, связанному с 8-OHdG (см. рисунок). [26] Это, вероятно, позволяет TET1 деметилировать смежный метилированный цитозин. Когда эпителиальные клетки молочной железы человека (MCF-10A) обрабатывали H 2 O 2 , 8-OHdG увеличивался в ДНК в 3,5 раза, и это вызывало около 80% деметилирования 5-метилцитозинов в геноме MCF-10A. [26]
Ген белка раннего роста 1 ( EGR1 ) является немедленным ранним геном (IEG). EGR1 может быстро индуцироваться нейронной активностью. [34] Определяющей характеристикой IEG является быстрое и временное повышение — в течение нескольких минут — их уровней мРНК независимо от синтеза белка. [35] Во взрослом возрасте EGR1 широко экспрессируется по всему мозгу, поддерживая базовые уровни экспрессии в нескольких ключевых областях мозга, включая медиальную префронтальную кору, полосатое тело, гиппокамп и миндалевидное тело. [35] Эта экспрессия связана с контролем познания, эмоциональной реакции, социального поведения и чувствительности к вознаграждению. [35] EGR1 связывается с ДНК на участках с мотивами 5′-GCGTGGGCG-3′ и 5'-GCGGGGGCGG-3′, и эти мотивы встречаются в основном в промоторных областях генов. [34] Короткая изоформа TET1s экспрессируется в мозге. EGR1 и TET1s образуют комплекс, опосредованный C-концевыми областями обоих белков, независимо от ассоциации с ДНК. [34] EGR1 привлекает TET1s в геномные области, фланкирующие сайты связывания EGR1. [34] В присутствии EGR1 TET1s способен к локус-специфическому деметилированию и активации экспрессии нижестоящих генов, регулируемых EGR1. [34]
Как указано на рисунке выше, озаглавленном «Деметилирование 5-метилцитозина», первым шагом в активном деметилировании является окисление TET 5-метилцитозина (5mC) до 5-гидроксиметилцитозина (5hmC). Процесс деметилирования в некоторых тканях и в некоторых участках генома может остановиться на этом этапе. Как было рассмотрено Урибе-Льюисом и др. [36] , помимо того, что 5hmC является промежуточным звеном в активном деметилировании ДНК, 5hmC часто является стабильной модификацией ДНК. В геноме 5hmC находится в транскрипционно активных генах, регуляторных элементах и комплексах, связанных с хроматином. В частности, 5hmC динамически изменяется и положительно коррелирует с активной транскрипцией генов во время спецификации клеточной линии , а высокие уровни 5hmC обнаружены в эмбриональных стволовых клетках и в центральной нервной системе . [37] У людей дефектная 5-гидроксиметилирующая активность связана с фенотипом лимфопролиферации, иммунодефицита и аутоиммунитета. [38]
Третий этап деметилирования ДНК — удаление промежуточных продуктов деметилирования, образующихся ферментом TET, путем репарации оснований путем эксцизии . Как указано выше на этапе 2, после того, как 5mC сначала окисляется TET с образованием 5hmC, дальнейшее окисление 5hmC TET дает 5fC, а окисление 5fC TET дает 5caC. Как 5fC, так и 5caC распознаются ДНК-гликозилазой , TDG , ферментом репарации оснований путем эксцизии , как аномальное основание. Как показано на рисунке в этом разделе, TDG удаляет аномальное основание (например, 5fC), оставляя сахарофосфатный остов нетронутым, создавая апуриновый/апиримидиновый сайт, обычно называемый сайтом AP . На этом рисунке 8-OHdG остается в ДНК, так как он мог присутствовать, когда OGG1 привлек TET1 к сайту CpG с метилированным цитозином. После формирования сайта AP эндонуклеаза AP создает надрез в фосфодиэфирном остове сайта AP , который образовался, когда ДНК-гликозилаза TDG удалила 5fC или 5caC. Человеческая эндонуклеаза AP разрезает ДНК 5' к сайту AP с помощью гидролитического механизма, оставляя остаток 3'-гидроксила и 5'-дезоксирибозофосфата (5' dRP). [39] За этим следует либо короткая, либо длинная заплатка для восстановления. При короткой заплатке для восстановления 5' dRP лиаза 5' обрезает конец 5' dRP, образуя фосфорилированный 5' конец. За этим следует ДНК- полимераза β (pol β), добавляющая один цитозин для спаривания с уже существующим гуанином в комплементарной цепи, а затем ДНК-лигаза для запечатывания разрезанной цепи. При репарации длинной заплатки синтез ДНК, как полагают, опосредован полимеразой δ и полимеразой ε, которые выполняют синтез смещения для формирования лоскута. Pol β также может выполнять синтез смещения длинной заплатки. Синтез длинной заплатки обычно вставляет 2–10 новых нуклеотидов. Затем эндонуклеаза лоскута удаляет лоскут, и за этим следует ДНК-лигаза, чтобы запечатать цепь. На этом этапе произошла полная замена 5-метилцитозина цитозином (деметилирование) в последовательности ДНК.
Физические упражнения оказывают хорошо известные полезные эффекты на обучение и память (см. Нейробиологические эффекты физических упражнений ). BDNF является особенно важным регулятором обучения и памяти. [40] Как было рассмотрено Фернандесом и др., [41] у крыс, упражнения усиливают экспрессию гена Bdnf в гиппокампе , который играет важную роль в формировании памяти. Усиленная экспрессия Bdnf происходит посредством деметилирования его промотора острова CpG в экзоне IV [41] , и это деметилирование зависит от этапов, проиллюстрированных на двух рисунках. [20]
В группе здоровых взрослых были обнаружены отрицательные ассоциации между общим метилированием ДНК и воздействием загрязнения воздуха, связанного с транспортом. Уровни метилирования ДНК были связаны как с недавним, так и с хроническим воздействием черного углерода, а также бензола. [42]
После травмы нейроны во взрослой периферической нервной системе могут переходить из состояния покоя с небольшим ростом аксонов в стадию активной регенерации аксонов . Деметилирование ДНК в зрелых нейронах млекопитающих устраняет барьеры для регенерации аксонов. [43] Это деметилирование при регенерации периферических нейронов мышей зависит от TET3 для генерации 5-гидроксиметилцитозина (5hmC) в ДНК. [43] [44] 5hmC был изменен в большом наборе генов, связанных с регенерацией (RAG), включая такие известные RAG, как Atf3 , Bdnf и Smad1 , которые регулируют потенциал роста аксонов нейронов. [44]