В иммунологии экстравазация лейкоцитов (также широко известная как каскад адгезии лейкоцитов или диапедез — прохождение клеток через неповрежденную стенку сосуда) — это перемещение лейкоцитов (белых кровяных клеток) из кровеносной системы ( экстравазация ) к месту повреждения ткани или инфекции . Этот процесс является частью врожденного иммунного ответа , включающего набор неспецифических лейкоцитов. Моноциты также используют этот процесс при отсутствии инфекции или повреждения ткани во время своего развития в макрофаги .
Лейкоцитарная экстравазация происходит в основном в посткапиллярных венулах , где гемодинамические сдвиговые силы минимизированы. Этот процесс можно понять в несколько этапов: [ необходима цитата ]
Было показано, что при подавлении любого из этих этапов прекращается прирост лейкоцитов.
Белые кровяные клетки (лейкоциты) выполняют большую часть своих функций в тканях. Функции включают фагоцитоз инородных частиц, выработку антител, секрецию триггеров воспалительной реакции (гистамина и гепарина) и нейтрализацию гистамина. В целом лейкоциты участвуют в защите организма и защищают его от болезней, способствуя или подавляя воспалительные реакции. Лейкоциты используют кровь в качестве транспортной среды для достижения тканей организма. Вот краткое описание каждого из четырех этапов, которые в настоящее время считаются вовлеченными в экстравазацию лейкоцитов:
При распознавании и активации патогенами резидентные макрофаги в пораженной ткани высвобождают цитокины, такие как IL-1 , TNFα и хемокины . IL-1, TNFα и C5a [1] заставляют эндотелиальные клетки кровеносных сосудов вблизи места инфекции экспрессировать молекулы клеточной адгезии , включая селектины . Циркулирующие лейкоциты локализуются в направлении места повреждения или инфекции из-за присутствия хемокинов. [ необходима цитата ]
Подобно липучке, углеводные лиганды на циркулирующих лейкоцитах связываются с молекулами селектина на внутренней стенке сосуда с пограничным сродством . Это заставляет лейкоциты замедляться и начинать катиться по внутренней поверхности стенки сосуда. Во время этого катящегося движения между селектинами и их лигандами образуются и разрываются временные связи .
Например, углеводный лиганд для P-селектина, P-селектин гликопротеиновый лиганд-1 (PSGL-1), экспрессируется различными типами лейкоцитов (белых кровяных клеток). Связывание PSGL-1 на лейкоците с P-селектином на эндотелиальной клетке позволяет лейкоцитарному белку катиться по эндотелиальной поверхности. Это взаимодействие может быть настроено с помощью паттерна гликозилирования PSGL-1, так что определенные гликоварианты PSGL-1 будут иметь уникальное сродство к различным селектинам, что в некоторых случаях позволяет клеткам мигрировать в определенные места в организме (например, в кожу). [2]
В то же время хемокины, высвобождаемые макрофагами, активируют катящиеся лейкоциты и заставляют молекулы поверхностного интегрина переключаться из состояния с низким сродством по умолчанию в состояние с высоким сродством. Этому способствует юкстакринная активация интегринов хемокинами и растворимыми факторами, высвобождаемыми эндотелиальными клетками. В активированном состоянии интегрины прочно связываются с комплементарными рецепторами, экспрессируемыми на эндотелиальных клетках, с высоким сродством. Это вызывает иммобилизацию лейкоцитов, которая варьируется в сосудах, содержащих различные силы сдвига текущего кровотока. [ необходима цитата ]
Цитоскелеты лейкоцитов реорганизуются таким образом, что лейкоциты распределяются по эндотелиальным клеткам. В этой форме лейкоциты расширяют псевдоподии и проходят через щели между эндотелиальными клетками. Этот проход клеток через неповрежденную стенку сосуда называется диапедезом . [3] Эти щели могут образовываться посредством взаимодействия лейкоцитов с эндотелием, но также и автономно посредством эндотелиальной механики. [ 4] Трансмиграция лейкоцита происходит, когда белки PECAM , обнаруженные на поверхностях лейкоцитов и эндотелиальных клеток, взаимодействуют и эффективно протягивают клетку через эндотелий. Пройдя через эндотелий, лейкоцит должен проникнуть через базальную мембрану . Механизм проникновения оспаривается, но может включать протеолитическое переваривание мембраны, механическую силу или и то, и другое. [5] Весь процесс выхода из кровеносного сосуда известен как диапедез . Попав в интерстициальную жидкость , лейкоциты мигрируют по хемотаксическому градиенту к месту повреждения или инфекции.
Фазы экстравазации лейкоцитов, изображенные на схеме, следующие: приближение, захват, вращение, активация, связывание, усиление связывания и распространение, внутрисосудистое проникновение, парацеллюлярная миграция или трансцеллюлярная миграция.
Селектины экспрессируются вскоре после активации цитокином эндотелиальных клеток тканевыми макрофагами. Активированные эндотелиальные клетки первоначально экспрессируют молекулы P-селектина, но в течение двух часов после активации экспрессия E-селектина становится предпочтительной. Эндотелиальные селектины связывают углеводы на трансмембранных гликопротеинах лейкоцитов , включая сиалил-Льюис X.
Подавленная экспрессия некоторых селектинов приводит к более медленному иммунному ответу. Если L-селектин не вырабатывается, иммунный ответ может быть в десять раз медленнее, так как P-селектины (которые также могут вырабатываться лейкоцитами) связываются друг с другом. P-селектины могут связываться друг с другом с высокой аффинностью, но встречаются реже, поскольку плотность рецепторных участков ниже, чем у более мелких молекул E-селектина. Это увеличивает начальную скорость прокатки лейкоцитов, продлевая фазу медленной прокатки.
Интегрины, участвующие в клеточной адгезии, в основном экспрессируются на лейкоцитах. Интегрины β2 на подвижных лейкоцитах связывают молекулы клеточной адгезии эндотелия , останавливая движение клеток.
Клеточная активация посредством внеклеточных хемокинов приводит к высвобождению предварительно сформированных β2-интегринов из клеточных хранилищ. Молекулы интегрина мигрируют на поверхность клетки и собираются в высокоавидные участки . Внутриклеточные домены интегрина связываются с цитоскелетом лейкоцитов посредством посредничества цитозольных факторов, таких как талин , α-актинин и винкулин . Эта ассоциация вызывает конформационный сдвиг в третичной структуре интегрина , что позволяет лиганду получить доступ к сайту связывания. Двухвалентные катионы (например, Mg2 + ) также необходимы для связывания интегрина с лигандом.
Лиганды интегрина ICAM-1 и VCAM-1 активируются воспалительными цитокинами, в то время как ICAM-2 конститутивно экспрессируется некоторыми эндотелиальными клетками, но подавляется воспалительными цитокинами. ICAM-1 и ICAM-2 имеют два общих гомологичных N-концевых домена ; оба могут связывать LFA-1.
Во время хемотаксиса движение клеток облегчается связыванием β1-интегринов с компонентами внеклеточного матрикса : VLA-3, VLA-4 и VLA-5 с фибронектином , а VLA-2 и VLA-3 с коллагеном и другими компонентами внеклеточного матрикса.
Экстравазация регулируется фоновой цитокиновой средой, создаваемой воспалительной реакцией , и не зависит от специфических клеточных антигенов . Цитокины, высвобождаемые при первичной иммунной реакции, вызывают вазодилатацию и снижают электрический заряд вдоль поверхности сосуда. Кровоток замедляется, что облегчает межмолекулярное связывание.
В 1976 году изображения SEM показали, что на кончиках лейкоцитов, похожих на микроворсинки, имеются рецепторы самонаведения, которые позволяют лейкоцитам выходить из кровеносного сосуда и попадать в ткань. [7] С 1990-х годов активно изучалась идентичность лигандов, участвующих в экстравазации лейкоцитов. Наконец, эту тему удалось тщательно изучить в условиях физиологического напряжения сдвига с использованием типичной проточной камеры. [8] С момента первых экспериментов было обнаружено странное явление. Было обнаружено, что связывающие взаимодействия между лейкоцитами и стенками сосудов становятся сильнее при более высокой силе. Было обнаружено, что в этом явлении участвуют селектины (E-селектин, L-селектин и P-селектин). Требование порога сдвига кажется противоречащим здравому смыслу, поскольку увеличение сдвига увеличивает силу, прикладываемую к адгезивным связям, и, казалось бы, это должно увеличивать способность к смещению. Тем не менее, клетки катятся медленнее и более равномерно, пока не будет достигнут оптимальный сдвиг, при котором скорость качения минимальна. Несмотря на широкий интерес, это парадоксальное явление не получило удовлетворительного объяснения.
Одной из первоначально отклоненных гипотез, которая набирает интерес, является гипотеза о связях захвата, в которой увеличенная сила на клетке замедляет скорости диссоциации и удлиняет время жизни связей, а также стабилизирует этап прокатки лейкоцитарной экстравазации. [9] Поток-зависимая клеточная адгезия все еще остается необъяснимым явлением, которое может быть результатом зависящего от транспорта увеличения скоростей диссоциации или зависящего от силы уменьшения скоростей диссоциации адгезивных связей. L-селектину требуется определенный минимум сдвига для поддержания прокатки лейкоцитов на лиганде гликопротеина P-селектина-1 (PSGL-1) и других сосудистых лигандах. Была выдвинута гипотеза, что низкие силы снижают скорости диссоциации L-селектина–PSGL-1 (связи захвата), тогда как более высокие силы увеличивают скорости диссоциации (связи скольжения). Эксперименты показали, что зависящее от силы уменьшение скоростей диссоциации диктует усиленное потоком прокатку микросфер или нейтрофилов, содержащих L-селектин, на PSGL-1. [5] Связи захвата позволяют увеличивать силу для преобразования коротких сроков жизни связей в длинные сроки жизни связей, что снижает скорости качения и увеличивает регулярность этапов качения по мере того, как сдвиг увеличивается от порогового значения до оптимального значения. По мере увеличения сдвига переходы к связям скольжения сокращают их сроки жизни связей, увеличивают скорости качения и уменьшают регулярность качения. Предполагается, что зависящие от силы изменения сроков жизни связей управляют клеточной адгезией, зависящей от L-селектина, ниже и выше оптимума сдвига. Эти результаты устанавливают биологическую функцию связей захвата как механизма клеточной адгезии, усиленной потоком. [10] В то время как лейкоциты, по-видимому, подвергаются поведению связей захвата с увеличением потока, что приводит к этапам связывания и качения при экстравазации лейкоцитов, прочная адгезия достигается посредством другого механизма — активации интегрина.
Другие биологические примеры механизма цепной связи наблюдаются у бактерий, которые плотно прилегают к стенкам мочевыводящих путей в ответ на высокие скорости жидкости и большие сдвиговые силы, оказываемые на клетки и бактерии с адгезивными кончиками фимбрий. [9] [11] Схематические механизмы того, как повышенная сдвиговая сила, как предполагается, вызывает более сильные связывающие взаимодействия между бактериями и целевыми клетками, показывают, что цепная связь действует очень похоже на китайскую ловушку для пальцев. Для цепной связи сила, действующая на клетку, тянет адгезивный кончик фимбрии, чтобы плотнее закрыть ее целевую клетку. По мере увеличения силы силы тем сильнее связь между фимбрией и клеткой-рецептором на поверхности целевой клетки. [11] Для криптической связи сила заставляет фимбрию поворачиваться к целевой клетке и иметь больше участков связывания, способных прикрепляться к лигандам целевой клетки, в основном молекулам сахара. Это создает более сильное связывающее взаимодействие между бактериями и целевой клеткой.
Параллельные пластинчатые проточные камеры являются одними из самых популярных проточных камер, используемых для изучения взаимодействия лейкоцитов и эндотелия in vitro. Они используются для исследований с конца 1980-х годов. [12] Хотя проточные камеры были важным инструментом для изучения прокатки лейкоцитов, существует несколько ограничений, когда дело доходит до изучения физиологических условий in vivo, поскольку они не соответствуют геометрии in vivo, включая соотношение масштаба и аспекта (микрососуды против моделей крупных сосудов), условия потока (например, сходящиеся против расходящихся потоков в бифуркациях) и требуют больших объемов реагентов (~ мл) из-за их большого размера (высота > 250 мкм и ширина > 1 мм). [13] С появлением устройств на основе микрофлюидики эти ограничения были преодолены. Новая модель in vitro, называемая SynVivo Synthetic microvascular network (SMN), была создана CFD Research Corporation (CFDRC) и разработана с использованием процесса мягкой литографии на основе полидиметилсилоксана (PDMS). SMN может воссоздать сложную сосудистую сеть in vivo, включая геометрические особенности, условия потока и объемы реагентов, тем самым обеспечивая биологически реалистичную среду для изучения поведения клеток при экстравазации, а также для доставки лекарств и их обнаружения. [14] [15]
Дефицит адгезии лейкоцитов (LAD) — генетическое заболевание, связанное с дефектом процесса экстравазации лейкоцитов, вызванным дефектной цепью интегрина β2 (обнаруженной в LFA-1 и Mac-1). Это нарушает способность лейкоцитов останавливаться и подвергаться диапедезу. Люди с LAD страдают от рецидивирующих бактериальных инфекций и ухудшенного заживления ран. Нейтрофилия является отличительной чертой LAD.
При распространенных заболеваниях, таких как сепсис, экстравазация лейкоцитов переходит в неконтролируемую стадию, когда нейтрофилы белой крови начинают разрушать ткани хозяина с беспрецедентной скоростью, унося жизни около 200 000 человек только в Соединенных Штатах. [16] Дисфункции нейтрофилов обычно предшествует какая-либо инфекция, которая запускает патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP). По мере усиления экстравазации лейкоцитов все больше тканей повреждаются нейтрофилами, которые выделяют кислородные радикалы и протеазы. [16]
Недавние исследования с SynVivo Synthetic microvascular network (SMN) позволили изучить противовоспалительные терапевтические средства для лечения патологий, вызванных дисфункцией нейтрофилов. SMN позволяет проводить тщательный анализ каждой стадии экстравазации лейкоцитов, тем самым предоставляя методологию для количественной оценки эффекта препарата в препятствовании экстравазации лейкоцитов. Некоторые из недавних результатов демонстрируют влияние гидродинамики на нейтрофильно-эндотелиальные взаимодействия. Другими словами, адгезия нейтрофилов сильно зависит от сдвиговых сил, а также от молекулярных взаимодействий. Более того, по мере снижения скорости сдвига (например, в посткапиллярных венулах) иммобилизация лейкоцитов становится легче и, таким образом, более распространенной. Обратное также верно: сосуды, в которых сдвиговые силы высоки, затрудняют иммобилизацию лейкоцитов. Это имеет большое значение при различных заболеваниях, где нарушения кровотока серьезно влияют на реакцию иммунной системы, затрудняя или ускоряя иммобилизацию лейкоцитов. Наличие этих знаний позволяет лучше изучать влияние лекарств на экстравазацию лейкоцитов. [13] [16] [14]