В микробиологии термин «выделение» относится к отделению штамма от естественной смешанной популяции живых микробов , присутствующих в окружающей среде, например, в воде или почве , или от живых существ с кожной флорой , флорой полости рта или кишечной флорой . для идентификации интересующего микроба(ов). [1] Исторически сложилось так, что лабораторные методы изоляции впервые были разработаны в области бактериологии и паразитологии (в 19 веке), а затем в вирусологии в 20 веке.
Лабораторные методы выделения микробов впервые были разработаны в 19 в. в области бактериологии и паразитологии с использованием световой микроскопии . 1860 год ознаменовался успешным внедрением Луи Пастером жидкой среды . Разработанная Пастером жидкая культура позволила визуализировать стимулирование или ингибирование роста конкретных бактерий. Тот же самый метод используется сегодня с использованием различных сред, таких как маннитоловый солевой агар , твердая среда. Твердые культуры были разработаны в 1881 году, когда Роберт Кох затвердел жидкие среды путем добавления агара [2].
Надлежащих методов изоляции в вирусологии не существовало до 20 века. Методы выделения микробов радикально изменились за последние 50 лет с точки зрения труда с ростом механизации, а также с точки зрения используемых технологий, а вместе с ними и скорости и точности.
Чтобы изолировать микроб из естественной смешанной популяции живых микробов , присутствующих в окружающей среде, например, в водной или почвенной флоре , или от живых существ с флорой кожи , флорой полости рта или кишечной флорой , необходимо отделить его от микс.
Традиционно микробы культивировали для идентификации интересующих микробов на основе характеристик их роста. В зависимости от ожидаемой плотности и жизнеспособности микробов, присутствующих в жидком образце, могут быть выбраны физические методы увеличения градиента, такие как, например , серийное разведение или центрифугирование . Чтобы изолировать организмы в материалах с высоким содержанием микробов, таких как сточные воды, почва или фекалии, серийные разведения увеличивают вероятность разделения смеси.
В жидкой среде с небольшим количеством ожидаемых организмов или без них, из области, которая обычно стерильна (например, спинномозговая жидкость , кровь внутри системы кровообращения), центрифугирование, декантация надосадочной жидкости и использование только осадка увеличивают вероятность роста и выделения бактерий или обычно клеточно-ассоциированные вирусы.
Если кто-то ожидает или ищет особенно привередливый организм, микробиологическая культура и методы изоляции должны быть ориентированы на этот микроб. Например, бактерию, которая погибает на воздухе, можно выделить только в том случае, если образец переносится и обрабатывается в безвоздушных или анаэробных условиях. Бактерии, которая погибает при воздействии комнатной температуры (термофильные), требуется предварительно нагретый транспортный контейнер, а микробу, который высыхает и умирает при переноске на ватном тампоне, для успешного культивирования потребуется вирусная транспортная среда.
Лаборанты инокулируют образец на определенные чашки с твердым агаром методом штриховых пластинок или в жидкую культуральную среду , в зависимости от цели выделения:
После того, как образец инокулируется в выбранную среду или на нее, его инкубируют при соответствующих атмосферных условиях, таких как аэробные, анаэробные или микроаэрофильные условия, или с добавлением диоксида углерода (5%), при различных настройках температуры, например 37 °C в инкубатор или холодильник для холодного обогащения, при соответствующем освещении, например, строго без света, завернутый в бумагу или в темную бутылку для скотохромогенных микобактерий , и на разное время, поскольку разные бактерии растут с разной скоростью, варьирующейся от нескольких часов ( Escherichia coli ) до недель (например, микобактерии ).
Лаборанты и микробиологи через регулярные промежутки времени проверяют среду на предмет видимых признаков роста и записывают их. Проверка снова должна проводиться в условиях, благоприятствующих выживанию изолята, т.е. в «анаэробной камере» для анаэробных бактерий, например, и в условиях, которые не угрожают человеку, смотрящему на чашки, заразиться особо инфекционным микробом, т.е. например, шкаф биологической безопасности для Yersinia pestis (чума) или Bacillus anthracis (сибирская язва).
Когда бактерии заметно выросли, они часто все еще смешаны. Идентификация микроба зависит от выделения отдельной колонии , так же как биохимическое тестирование микроба для определения его различных физиологических особенностей зависит от чистой культуры . Чтобы создать субкультуру , снова применяют асептические методы микробиологии : поднимают одну колонию с поверхности агара с помощью петли и распределяют материал по 4 квадрантам агаровой чашки или по всему периметру, если колония была одиночной и не выглядела смешанной. .
Окрашивание по Граму позволяет визуализировать состав клеточной стенки бактерий на основе цвета, который окрашивают бактерии после серии этапов окрашивания и обесцвечивания. [4] Этот процесс окрашивания позволяет идентифицировать грамотрицательные и грамположительные бактерии. Грамотрицательные бактерии окрашиваются в розовый цвет из-за тонкого слоя пептидогликана. Если бактерия окрашивается в фиолетовый цвет из-за толстого слоя пептидогликана, это грамположительная бактерия. [4]
В клинической микробиологии используются многочисленные другие методы окрашивания конкретных организмов (кислотностойкое бактериальное окрашивание на микобактерии). Методы иммунологического окрашивания, такие как прямая иммунофлуоресценция, были разработаны для важных с медицинской точки зрения патогенов , которые медленно растут ( окрашивание аурамин-родамином для микобактерий ) или трудно растут (например, виды Legionella pneumophila ), и когда результат теста может изменить стандартное лечение и эмпирическую терапию. .
Биохимическое тестирование бактерий включает набор агаров во флаконах для отделения подвижных бактерий от неподвижных . В 1970 году была разработана миниатюрная версия, названная индексом аналитического профиля .
Успешная идентификация посредством, например, секвенирования генома и геномики, зависит от чистых культур.
Хотя наиболее быстрый метод идентификации бактерий — секвенирование их гена 16S рРНК , который предварительно был амплифицирован с помощью ПЦР, этот метод не требует выделения. Поскольку большинство бактерий невозможно вырастить обычными методами (особенно бактерии из окружающей среды или почвы), используются метагеномика или метатранскриптомика , дробовое секвенирование или секвенирование генома с помощью ПЦР . Секвенирование с помощью масс-спектрометрии , например, лазерная десорбция/ионизация с помощью матрицы (MALDI-TOF MS), используется при анализе клинических образцов для поиска патогенов. Полногеномное секвенирование — это вариант для отдельного организма, который невозможно охарактеризовать в достаточной степени для идентификации. Для идентификации также можно использовать небольшие микрочипы ДНК .