Иммуноанализ с объемным оптоволокном ( SOFIA ) представляет собой сверхчувствительную платформу для диагностики in vitro , включающую узел объемного оптоволокна , улавливающий флуоресцентное излучение всего образца. Определяющими характеристиками этой технологии являются чрезвычайно высокий предел обнаружения , чувствительность и динамический диапазон . Чувствительность SOFIA измеряется на уровне аттограмм (10–18 г ), что делает ее примерно в миллиард раз более чувствительной, чем традиционные диагностические методы. Благодаря расширенному динамическому диапазону SOFIA способен различать уровни аналита в образце более чем на 10 порядков , что способствует точному титрованию . [ нужна цитата ]
Как диагностическая платформа SOFIA имеет широкий спектр приложений. Несколько исследований уже продемонстрировали беспрецедентную способность SOFIA обнаруживать природные прионы в крови и моче носителей заболеваний. [1] [2] [3] Ожидается, что это приведет к созданию первого надежного прижизненного скринингового теста на vCJD , BSE , скрепи , CWD и другие трансмиссивные губчатые энцефалопатии . [4] Учитывая чрезвычайную чувствительность этой технологии, ожидаются дополнительные уникальные применения, включая испытания in vitro на другие нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера и Паркинсона . [3]
SOFIA была разработана в результате совместного исследовательского проекта Лос-Аламосской национальной лаборатории и государственного университета Нью-Йорка и поддерживалась Национальной программой исследования прионов Министерства обороны .
Обычный метод проведения лазерно-индуцированной флуоресценции, а также других типов спектроскопических измерений , таких как инфракрасная , ультрафиолетовая-видимая спектроскопия , фосфоресценция и т. д., заключается в использовании небольшого прозрачного лабораторного сосуда, кюветы , для содержания образца в быть проанализированы. [ нужна цитата ]
Для проведения измерения кювета заполняется исследуемой жидкостью, а затем освещается лазером, сфокусированным через одну из сторон кюветы. Линзу размещают на одной из граней кюветы, расположенной под углом 90° от входного окна, для сбора индуцированного лазером флуоресцентного света. Лишь небольшой объем кюветы фактически освещается лазером и производит заметное спектроскопическое излучение. Выходной сигнал значительно снижается, поскольку линза улавливает только около 10% спектроскопического излучения из-за соображений телесного угла. Этот метод используется уже не менее 75 лет; еще до появления лазера, когда для возбуждения флуоресценции использовались обычные источники света. [5]
SOFIA решает проблему низкой эффективности сбора, поскольку она собирает почти весь флуоресцентный свет, излучаемый анализируемым образцом, увеличивая количество сигнала флуоресценции примерно в 10 раз по сравнению с обычными приборами.
SOFIA — это устройство и метод улучшения оптической геометрии для улучшения спектроскопического обнаружения аналитов в образце. Изобретение уже продемонстрировало свою функциональность в качестве устройства и метода сверхчувствительного обнаружения прионов и других низкоактивных аналитов. SOFIA сочетает в себе специфичность, присущую моноклональным антителам для захвата антигена, с чувствительностью технологии объемного оптического обнаружения. Для обнаружения чрезвычайно низких уровней сигнала в качестве детектора системы используется малошумящий фотоэлектрический диод. SOFIA использует лазер для освещения микрокапиллярной трубки, в которой находится образец. Затем собранный из образца свет направляется на передающую оптику из оптических волокон. Затем свет оптически фильтруется для обнаружения, которое выполняется как измерение тока, усиленное шумом с помощью синхронного усиления цифровой обработки сигнала. Результаты отображаются на компьютере и программном обеспечении, предназначенном для сбора данных. [ нужна цитата ]
Преимущества такой матрицы обнаружения многочисленны. Прежде всего, это позволяет использовать очень маленькие образцы при низкой концентрации для оптимального исследования с использованием метода лазерно-индуцированной флуоресценции. Эта система обнаружения на основе оптоволокна адаптируется к существующему оборудованию для обнаружения коротких импульсов , которое изначально было разработано для секвенирования отдельных молекул ДНК. Геометрия также пригодна для использования в схемах короткоимпульсного лазера и обнаружения одиночных молекул. Многопортовая геометрия системы обеспечивает эффективную электронную обработку сигналов с каждого плеча устройства. Наконец, что, пожалуй, самое главное, оптоволоконные кабели практически на 100% эффективны при оптической передаче, имея затухание менее 10 дБ /км. Таким образом, после развертывания для использования на объекте информация о флуоресценции может быть передана по оптоволоконному кабелю в удаленное место, где можно выполнить обработку и анализ данных.
SOFIA включает в себя контейнер для образцов многолуночного планшета, автоматизированное средство для последовательной транспортировки образцов из контейнера для образцов многолуночного планшета в прозрачный капилляр, содержащийся внутри держателя образца, источник возбуждения, имеющий оптическую связь с образцом, при этом излучение источника возбуждения направлено вдоль длина капилляра, при этом излучение индуцирует сигнал, излучаемый образцом, и по меньшей мере одну линейную решетку. [ нужна цитата ]
После амплификации и последующего концентрирования целевого аналита образцы метят флуоресцентным красителем с использованием антитела для специфичности, а затем, наконец, загружают в микрокапиллярную трубку. Эта трубка помещена в специально сконструированное устройство, поэтому она полностью окружена оптическими волокнами, улавливающими весь свет, излучаемый при возбуждении красителя с помощью лазера. [6]
Это оборудование представляет собой спектроскопический (светособирающий) прибор и соответствующий метод быстрого обнаружения и анализа аналитов в образце. Образец облучается источником возбуждения, имеющим оптическую связь с образцом. Источник возбуждения может включать в себя, помимо прочего, лазер, лампу-вспышку, дуговую лампу, светоизлучающий диод и т.п.
На рисунке 1 изображена текущая версия системы SOFIA. Четыре линейные матрицы (101) проходят от держателя проб (102), в котором находится удлиненный прозрачный контейнер для проб, открытый с обоих концов, до концевого порта (103). Дистальный конец концевого порта (104) вставлен в узел концевого порта (200). Линейные массивы (101) содержат множество оптических волокон, имеющих первый конец и второй конец, причем множество оптических волокон необязательно окружены защитной и/или изолирующей оболочкой. Оптические волокна расположены линейно, что означает, что они по существу копланарны друг другу, образуя удлиненный ряд волокон.
Представляющий интерес аналит может иметь биологическую или химическую природу и, например, может включать только химические фрагменты (токсины, метаболиты, лекарства и остатки лекарств), пептиды , белки, клеточные компоненты, вирусы и их комбинации. Представляющий интерес аналит может находиться либо в жидкости, либо в поддерживающей среде, такой как гель.
СОФИЯ продемонстрировала свой потенциал как устройство с широким спектром применения. К ним относятся клинические применения, такие как выявление заболеваний, обнаружение предрасположенности к патологиям, установление диагноза и отслеживание эффективности назначенного лечения, а также доклинические применения, такие как предотвращение попадания токсинов и других патогенных агентов в продукты, предназначенные для потребления человеком:
SOFIA используется для быстрого обнаружения аномальной формы прионного белка ( PrP Sc ) в образцах жидкостей организма, таких как кровь или моча. PrP Sc является маркерным белком, используемым в диагностике трансмиссивных губчатых энцефалопатий (TSE), примеры которых включают губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (т.е. «коровье бешенство»), скрепи у овец и болезнь Крейцфельдта-Якоба у людей. В настоящее время не существует быстрых средств прижизненного обнаружения PrP Sc в разбавленных количествах, в которых он обычно появляется в жидкостях организма. Преимущество SOFIA состоит в том, что она требует минимальной подготовки проб и позволяет размещать электронное диагностическое оборудование за пределами зоны содержания.
ТГЭ, или прионные заболевания, представляют собой инфекционные нейродегенеративные заболевания млекопитающих, которые включают губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота, хроническую истощающую болезнь оленей и лосей, скрепи у овец и болезнь Крейтцфельдта-Якоба (БКЯ) у людей. ТГЭ могут передаваться от хозяина к хозяину при проглатывании инфицированных тканей или при переливании крови. Клинические симптомы ТГЭ включают потерю движений и координации, а также деменцию у людей. Инкубационный период у них составляет от нескольких месяцев до нескольких лет, но после появления клинических признаков они быстро прогрессируют, не поддаются лечению и неизменно заканчиваются летальным исходом. Попытки снизить риск ТГЭ привели к значительным изменениям в производстве и торговле сельскохозяйственной продукцией, лекарствами, косметикой, донорской кровью и тканями, а также биотехнологической продукцией. Посмертное невропатологическое исследование ткани головного мозга животного или человека остается «золотым стандартом» диагностики ТГЭ и является очень специфичным, но не таким чувствительным, как другие методы. [7]
Для повышения безопасности пищевых продуктов было бы полезно проверять всех животных на прионные заболевания с помощью прижизненного доклинического тестирования, т.е. тестирования до появления симптомов. Однако уровни PrP Sc очень низкие у предсимптомных хозяев. Кроме того, PrP Sc обычно неравномерно распределяются в тканях организма: самые высокие концентрации постоянно обнаруживаются в тканях нервной системы, а очень низкие концентрации - в легкодоступных жидкостях организма, таких как кровь или моча. Следовательно, любой такой тест потребуется для обнаружения чрезвычайно малых количеств PrP и дифференциации PrP C и PrP Sc .
Современные методы обнаружения PrP Sc требуют много времени и включают посмертный анализ после того, как у подозрительных животных проявляются один или несколько симптомов заболевания. Современные методы диагностики основаны главным образом на выявлении физико-химических различий между PrPC и PrP Sc , которые на сегодняшний день являются единственными надежными маркерами ТГЭ. Например, наиболее широко используемые диагностические тесты используют относительную устойчивость PrP Sc к протеазам в образцах головного мозга для различения PrP C и PrP Sc в сочетании с обнаружением на основе антител PK -резистентной части PrP Sc . До сих пор не удалось обнаружить прионные заболевания с помощью традиционных методов, таких как полимеразная цепная реакция, серология или анализы на клеточных культурах. Нуклеиновая кислота, специфичная для агента, еще не идентифицирована, и инфицированный хозяин не вызывает реакции антител.
Конформационно измененной формой PrPC является PrP Sc . Некоторые группы считают, что PrP Sc является инфекционным агентом (прионным агентом) при ТГЭ, тогда как другие группы так не считают. PrP Sc может быть нейропатологическим продуктом патологического процесса, компонентом инфекционного агента, самим инфекционным агентом или чем-то еще. Независимо от того, какова его реальная функция в болезненном состоянии, PrP Sc явно специфически связан с болезненным процессом, и его обнаружение указывает на инфицирование агентом, вызывающим прионные заболевания.
СОФИА предоставляет, среди прочего, методы диагностики прионных заболеваний путем обнаружения PrP Sc в биологических образцах. Образцами могут быть ткань головного мозга, нервная ткань, кровь, моча, лимфатическая жидкость , спинномозговая жидкость или их комбинация. Отсутствие PrP Sc указывает на отсутствие заражения инфекционным агентом до пределов обнаружения методов. Обнаружение присутствия PrP Sc указывает на заражение инфекционным агентом, связанным с прионной болезнью. Заражение прионным агентом может быть обнаружено как на предсимптомной, так и на симптоматической стадии прогрессирования заболевания.
Эти и другие улучшения были достигнуты с помощью SOFIA. [3] Чувствительность и специфичность SOFIA устраняют необходимость расщепления PK для различения нормальных и аномальных изоформ PrP. Дальнейшее обнаружение PrP Sc в плазме крови было решено с помощью циклической амплификации ограниченного неправильного сворачивания белков (PMCA) с последующей SOFIA. Благодаря чувствительности SOFIA циклы PMCA могут быть сокращены, что снижает вероятность спонтанного образования PrP Sc и обнаружения ложноположительных образцов. SOFIA отвечает потребностям повышенной чувствительности при обнаружении прионных заболеваний у животных, инфицированных ТГЭ как с предсимптомной, так и с симптомами, включая людей, путем предоставления методов анализа с использованием высокочувствительного оборудования, которое требует меньше подготовки проб, чем ранее описанные методы, в сочетании с недавно разработанными Мабс против ПрП. Метод настоящей версии SOFIA обеспечивает уровни чувствительности, достаточные для обнаружения PrP Sc в ткани головного мозга. В сочетании с ограниченным количеством sPMCA способы настоящего изобретения обеспечивают уровни чувствительности, достаточные для обнаружения PrP Sc в плазме крови, тканях и других жидкостях, собранных прижизненно .
Эти методы сочетают в себе специфичность антител к захвату и концентрации антигена с чувствительностью технологии обнаружения по окружающему оптическому волокну. В отличие от ранее описанных методов обнаружения PrP Sc в гомогенатах головного мозга , эти методы при исследовании гомогенатов головного мозга не используют затравочную полимеризацию, амплификацию или ферментативное расщепление (например, протеиназой К или «ПК»). Это важно, поскольку в предыдущих отчетах указывалось на существование изоформ PrP Sc с различной чувствительностью к PK, что снижает надежность анализа. Чувствительность этого анализа делает его подходящим в качестве платформы для быстрого анализа обнаружения прионов в биологических жидкостях. Помимо прионных заболеваний, этот метод может предоставить средства для быстрого и высокопроизводительного тестирования широкого спектра инфекций и расстройств.
Хотя около 40 циклов sPMCA в сочетании с иммунопреципитацией оказались недостаточными для обнаружения PrP Sc в плазме с помощью ELISA или вестерн-блоттинга, было также обнаружено, что PrP Sc легко измеряется методами SOFIA. Ограниченное количество циклов, необходимое для существующей платформы анализа, практически исключает возможность получения связанных с PMCA ложноположительных результатов, подобных тем, о которых сообщалось ранее (Thorne and Terry, 2008). [8]
Благодаря быстрому развитию исследований биомаркеров многие инфекции и расстройства, которые невозможно диагностировать с помощью тестирования in vitro , становятся все более возможными. Прогнозируется, что SOFIA будет иметь более широкое применение при разработке диагностических тестов на инфекции и расстройства, выходящие за рамки прионных заболеваний. [3] Основным потенциальным применением является лечение других заболеваний, связанных с неправильным сворачиванием белков, в частности болезни Альцгеймера. [7]
В исследовании 2011 года сообщалось об обнаружении прионов в моче естественно и перорально инфицированных овец клиническим возбудителем скрепи, а также перорально инфицированных доклинических и инфицированных белохвостых оленей с клиническим хроническим истощающим заболеванием (CWD). Это первый отчет об обнаружении приона PrP Sc в моче овец или оленьих, больных естественным или доклиническим заболеванием прионом. [1]
Исследование 2010 года продемонстрировало, что умеренное количество циклической амплификации неправильного сворачивания белка (PMCA) в сочетании с новой схемой обнаружения SOFIA может использоваться для обнаружения PrP Sc в необработанной протеазой плазме доклинических и клинических овец-скрэпи и белохвостых оленей с хроническим истощением. заболевание, возникающее вследствие естественного и экспериментального заражения. Связанная с заболеванием форма прионного белка (PrP Sc ), возникающая в результате конформационного изменения нормальной (клеточной) формы прионного белка (PrP C ), считается центральной в нейропатогенезе и служит единственным надежным молекулярным маркером прионного заболевания. диагноз. Хотя самые высокие уровни PrP Sc присутствуют в ЦНС, разработка разумного диагностического анализа требует использования жидкостей организма, которые обычно содержат чрезвычайно низкие уровни PrP Sc . PrP Sc обнаружен в крови больных животных с помощью технологии PMCA. Однако сообщалось, что повторная циклическая обработка в течение нескольких дней, необходимая для PMCA материала крови, приводит к снижению специфичности (ложноположительные результаты). Чтобы создать высокочувствительный и специфичный анализ на PrP Sc в крови, исследователи использовали ограниченный серийный анализ PMCA (sPMCA) с SOFIA. Они не обнаружили какого-либо усиления sPMCA при добавлении полиадениловой кислоты, и не было необходимости сопоставлять генотипы источников PrPC и PrP Sc для эффективной амплификации. [2]
Исследование 2009 года показало, что SOFIA в своем нынешнем формате способна обнаруживать менее 10 аттограмм (акг) рекомбинантного PrP хомяка, овцы и оленя. Около 10 мкг PrP Sc из мозга хомяков, инфицированных 263K, можно обнаружить с аналогичными нижними пределами обнаружения PrP Sc в мозге овец, инфицированных скрепи, и оленей, инфицированных хроническим истощением. Эти пределы обнаружения позволяют разбавлять обработанный и необработанный протеазой материал до уровня, при котором PrPC , неспецифические белки или другие посторонние материалы могут мешать обнаружению и/или специфичности сигнала PrP Sc . Это не только снимает вопрос о специфичности обнаружения PrP Sc , но и повышает чувствительность, поскольку возможность частичного протеолиза PrP Sc больше не вызывает опасений. SOFIA, вероятно, приведет к раннему прижизненному выявлению трансмиссивных энцефалопатий, а также может использоваться с дополнительными протоколами целевой амплификации. SOFIA представляет собой чувствительный способ обнаружения специфических белков, участвующих в патогенезе и/или диагностике заболеваний, выходящих за рамки трансмиссивных губчатых энцефалопатий. [3]
{{cite journal}}: Требуется цитировать журнал |journal=( помощь )