Мечение иммунозолотом или окрашивание иммунозолотом ( IGS ) – это метод окрашивания, используемый в электронной микроскопии . [2] Этот метод окрашивания является эквивалентом метода непрямой иммунофлуоресценции для видимого света. Частицы коллоидного золота чаще всего прикрепляются к вторичным антителам , которые, в свою очередь, прикрепляются к первичным антителам , предназначенным для связывания конкретного антигена или другого компонента клетки . Золото используется из-за его высокой плотности электронов , которая увеличивает рассеяние электронов , создавая высококонтрастные «темные пятна». [3]
Мечение иммунозолотом, впервые использованное в 1971 году, применялось как в трансмиссионной электронной микроскопии , так и в сканирующей электронной микроскопии , а также в светлопольной микроскопии . Технику маркировки можно адаптировать для различения нескольких объектов за счет использования частиц золота разного размера.
Маркировка иммунозолотом может привести к появлению артефактов, поскольку частицы золота находятся на некотором расстоянии от меченого объекта, и во время подготовки пробы требуется получение очень тонких срезов. [3]
Маркировка иммунозолотом была впервые использована в 1971 году Фолком и Тейлором для идентификации антигенов сальмонеллы . [2] [4] Впервые он был применен в трансмиссионной электронной микроскопии (ПЭМ) и был особенно полезен при выделении белков, обнаруженных в низкой плотности, таких как некоторые антигены клеточной поверхности. [5] По мере роста разрешения сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) росла и потребность в метках размером с наночастицы, таких как иммунозолото. В 1975 году Хорисбергер и его коллеги успешно визуализировали наночастицы золота диаметром менее 30 нм [6] , и вскоре это стало общепринятым методом СЭМ. [5]
Сначала делается тонкий срез образца, часто с использованием микротома . [7] Затем могут быть выполнены различные другие этапы подготовки проб .
Подготовленный образец затем инкубируется со специфическим антителом, предназначенным для связывания интересующей молекулы. [3] Затем добавляется вторичное антитело, к которому прикреплены частицы золота, и оно связывается с первичным антителом. Золото также может быть присоединено к белку A или белку G вместо вторичного антитела, поскольку эти белки неспецифически связывают Fc-области IgG млекопитающих. [6]
Электронно-плотную частицу золота теперь можно увидеть под электронным микроскопом как черную точку, косвенно обозначающую интересующую молекулу. [3]
Маркировка Immunogold может использоваться для одновременной визуализации более чем одной мишени. Этого можно достичь в электронной микроскопии , используя две частицы золота разного размера. [8] В расширении этого метода использовались три частицы золота разного размера для отслеживания локализации регуляторных пептидов . [9] Более сложный метод многосайтовой маркировки включает в себя маркировку противоположных сторон антигенного сайта отдельно, после чего частицы иммунозолота, прикрепленные к обеим сторонам, можно просматривать одновременно. [10]
Хотя маркировка иммунозолотом обычно используется для трансмиссионной электронной микроскопии, когда золото «усилен серебром», его можно увидеть с помощью светлопольной микроскопии . [11] Увеличение серебра увеличивает размер частиц, что также делает возможным использование сканирующей электронной микроскопии. Для получения частиц золота, обогащенного серебром, частицы коллоидного золота помещаются в кислотный раствор , содержащий ионы серебра . Частицы золота затем действуют как центр зародышеобразования , и серебро осаждается на частице. Примером применения мечения иммунозолотом, усиленным серебром (IGSS), была идентификация возбудителя Erwinia amylovora . [11]
Неотъемлемым ограничением метода иммунозолота является то, что частица золота находится на расстоянии около 15-30 нм от места, с которым связано первичное антитело [5] (при использовании стратегии мечения первичных и вторичных антител ). Поэтому точное местоположение целевой молекулы невозможно точно рассчитать. Частицы золота могут быть созданы диаметром 1 нм (или меньше), но тогда реализуется еще одно ограничение: при таких размерах золотую метку становится трудно отличить от структуры ткани. [2] [5]
Для маркировки иммунозолотом необходимы тонкие срезы, и это может привести к вводящим в заблуждение изображениям; тонкий срез клеточного компонента может не дать точного представления о его трехмерной структуре . Например, микротрубочка может выглядеть как «шип» в зависимости от того, в какой плоскости произошло разделение. Чтобы преодолеть это ограничение, можно сделать серийные срезы, которые затем можно скомпилировать в трехмерное изображение. [3]
Еще одним ограничением является то, что антитела и частицы золота не могут проникнуть в смолу , используемую для заливки образцов для визуализации. Таким образом, только доступные молекулы могут быть нацелены и визуализированы. Маркировка перед внедрением образца может уменьшить негативное влияние этого ограничения. [3]