stringtranslate.com

Маркировка иммунозолотом

Два изображения, полученные с использованием мечения иммунозолотом и трансмиссионной электронной микроскопии: (A) Частицы золота маркируют мтДНК рядом с митохондриями (B) мтДНК, помеченная частицами золота после экстракции. [1]

Мечение иммунозолотом или окрашивание иммунозолотом ( IGS ) – это метод окрашивания, используемый в электронной микроскопии . [2] Этот метод окрашивания является эквивалентом метода непрямой иммунофлуоресценции для видимого света. Частицы коллоидного золота чаще всего прикрепляются к вторичным антителам , которые, в свою очередь, прикрепляются к первичным антителам , предназначенным для связывания конкретного антигена или другого компонента клетки . Золото используется из-за его высокой плотности электронов , которая увеличивает рассеяние электронов , создавая высококонтрастные «темные пятна». [3]

Мечение иммунозолотом, впервые использованное в 1971 году, применялось как в трансмиссионной электронной микроскопии , так и в сканирующей электронной микроскопии , а также в светлопольной микроскопии . Технику маркировки можно адаптировать для различения нескольких объектов за счет использования частиц золота разного размера.

Маркировка иммунозолотом может привести к появлению артефактов, поскольку частицы золота находятся на некотором расстоянии от меченого объекта, и во время подготовки пробы требуется получение очень тонких срезов. [3]

История

Маркировка иммунозолотом была впервые использована в 1971 году Фолком и Тейлором для идентификации антигенов сальмонеллы . [2] [4] Впервые он был применен в трансмиссионной электронной микроскопии (ПЭМ) и был особенно полезен при выделении белков, обнаруженных в низкой плотности, таких как некоторые антигены клеточной поверхности. [5] По мере роста разрешения сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) росла и потребность в метках размером с наночастицы, таких как иммунозолото. В 1975 году Хорисбергер и его коллеги успешно визуализировали наночастицы золота диаметром менее 30 нм [6] , и вскоре это стало общепринятым методом СЭМ. [5]

Техника

Сначала делается тонкий срез образца, часто с использованием микротома . [7] Затем могут быть выполнены различные другие этапы подготовки проб .

Подготовленный образец затем инкубируется со специфическим антителом, предназначенным для связывания интересующей молекулы. [3] Затем добавляется вторичное антитело, к которому прикреплены частицы золота, и оно связывается с первичным антителом. Золото также может быть присоединено к белку A или белку G вместо вторичного антитела, поскольку эти белки неспецифически связывают Fc-области IgG млекопитающих. [6]

Электронно-плотную частицу золота теперь можно увидеть под электронным микроскопом как черную точку, косвенно обозначающую интересующую молекулу. [3]

Маркировка нескольких объектов

Маркировка Immunogold может использоваться для одновременной визуализации более чем одной мишени. Этого можно достичь в электронной микроскопии , используя две частицы золота разного размера. [8] В расширении этого метода использовались три частицы золота разного размера для отслеживания локализации регуляторных пептидов . [9] Более сложный метод многосайтовой маркировки включает в себя маркировку противоположных сторон антигенного сайта отдельно, после чего частицы иммунозолота, прикрепленные к обеим сторонам, можно просматривать одновременно. [10]

Использование в светлопольной микроскопии

Хотя маркировка иммунозолотом обычно используется для трансмиссионной электронной микроскопии, когда золото «усилен серебром», его можно увидеть с помощью светлопольной микроскопии . [11] Увеличение серебра увеличивает размер частиц, что также делает возможным использование сканирующей электронной микроскопии. Для получения частиц золота, обогащенного серебром, частицы коллоидного золота помещаются в кислотный раствор , содержащий ионы серебра . Частицы золота затем действуют как центр зародышеобразования , и серебро осаждается на частице. Примером применения мечения иммунозолотом, усиленным серебром (IGSS), была идентификация возбудителя Erwinia amylovora . [11]

Ограничения

Неотъемлемым ограничением метода иммунозолота является то, что частица золота находится на расстоянии около 15-30 нм от места, с которым связано первичное антитело [5] (при использовании стратегии мечения первичных и вторичных антител ). Поэтому точное местоположение целевой молекулы невозможно точно рассчитать. Частицы золота могут быть созданы диаметром 1  нм (или меньше), но тогда реализуется еще одно ограничение: при таких размерах золотую метку становится трудно отличить от структуры ткани. [2] [5]

Для маркировки иммунозолотом необходимы тонкие срезы, и это может привести к вводящим в заблуждение изображениям; тонкий срез клеточного компонента может не дать точного представления о его трехмерной структуре . Например, микротрубочка может выглядеть как «шип» в зависимости от того, в какой плоскости произошло разделение. Чтобы преодолеть это ограничение, можно сделать серийные срезы, которые затем можно скомпилировать в трехмерное изображение. [3]

Еще одним ограничением является то, что антитела и частицы золота не могут проникнуть в смолу , используемую для заливки образцов для визуализации. Таким образом, только доступные молекулы могут быть нацелены и визуализированы. Маркировка перед внедрением образца может уменьшить негативное влияние этого ограничения. [3]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Иборра Ф.Дж., Кимура Х., Кук PR (2004). «Функциональная организация митохондриальных геномов в клетках человека». БМК Биол. 2 :9. дои : 10.1186/1741-7007-2-9 . ПМК  425603 . ПМИД  15157274.
  2. ^ abc «Метка иммунозолотом в сканирующей электронной микроскопии». Архивировано из оригинала 6 февраля 2014 г. Проверено 8 июля 2010 г.
  3. ^ abcdef Альбертс, Брюс; и другие. (2008). Молекулярная биология клетки (5-е изд.). Нью-Йорк: Garland Science. ISBN 978-0-8153-4106-2.
  4. ^ Фолк В.П., Тейлор GM (ноябрь 1971 г.). «Иммуноколлоидный метод для электронного микроскопа». Иммунохимия . 8 (11): 1081–3. дои : 10.1016/0019-2791(71)90496-4. ПМИД  4110101.
  5. ^ abcd Герман Р., Вальтер П., Мюллер М. (1996). «Метка иммунозолотом в сканирующей электронной микроскопии». Гистохимия и клеточная биология . 106 (1): 31–39. дои : 10.1007/BF02473200. ПМИД  8858365.
  6. ^ Аб Рот Дж., Бендаян М., Орчи Л. (декабрь 1978 г.). «Ультраструктурная локализация внутриклеточных антигенов с помощью комплекса белок А-золото». Дж. Гистохим. Цитохим . 26 (12): 1074–81. дои : 10.1177/26.12.366014 . ПМИД  366014.
  7. ^ Портер, К; Блюм, Дж (1953). «Исследование микротомии для электронной микроскопии». Анатомическая запись . 117 (4): 685–710. дои : 10.1002/ar.1091170403. ПМИД  13124776.
  8. ^ Рот Дж., Биндер М. (март 1978 г.). «Колоидное золото, ферритин и пероксидаза как маркеры для электронно-микроскопических методов двойного мечения лектина». Дж. Гистохим. Цитохим . 26 (3): 163–9. дои : 10.1177/26.3.632554 . ПМИД  632554.
  9. ^ Тапиа Ф.Дж., Варнделл И.М., Проберт Л., Де Мей Дж., Полак Дж.М. (июль 1983 г.). «Метод двойного иммунозолотого окрашивания для одновременной ультраструктурной локализации регуляторных пептидов». Дж. Гистохим. Цитохим . 31 (7): 977–81. дои : 10.1177/31.7.6189888 . ПМИД  6189888.
  10. ^ Бендаян М (январь 1982 г.). «Двойное иммуноцитохимическое мечение с использованием метода белка А-золота». Дж. Гистохим. Цитохим . 30 (1): 81–5. дои : 10.1177/30.1.6172469. ПМИД  6172469.
  11. ^ аб Ван Лаэр О, Де Ваэль Л, Де Мей Дж (1985). «Иммуноокрашивание золотом (IGS) и иммуноокрашивание золотом и серебром (IGSS) для идентификации патогенной для растений бактерии Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al». Гистохимия . 83 (5): 397–9. дои : 10.1007/BF00509198. ПМИД  2416717.