Молекулярное клонирование — это набор экспериментальных методов в молекулярной биологии , которые используются для сборки рекомбинантных молекул ДНК и управления их репликацией в организмах-хозяевах . [1] Использование слова «клонирование» относится к тому факту, что метод включает репликацию одной молекулы для получения популяции клеток с идентичными молекулами ДНК. Молекулярное клонирование обычно использует последовательности ДНК из двух разных организмов: вида, который является источником ДНК для клонирования, и вида, который будет служить живым хозяином для репликации рекомбинантной ДНК. Методы молекулярного клонирования являются центральными во многих современных областях современной биологии и медицины. [2]
В обычном эксперименте по молекулярному клонированию ДНК, которую нужно клонировать, получают из интересующего организма, затем обрабатывают ферментами в пробирке для получения более мелких фрагментов ДНК. Затем эти фрагменты объединяют с векторной ДНК для получения рекомбинантных молекул ДНК. Затем рекомбинантная ДНК вводится в организм-хозяин (обычно это легко выращиваемый, доброкачественный лабораторный штамм бактерий E. coli ). Это создаст популяцию организмов, в которых рекомбинантные молекулы ДНК реплицируются вместе с ДНК-хозяином. Поскольку они содержат чужеродные фрагменты ДНК, они являются трансгенными или генетически модифицированными микроорганизмами ( ГМО ). [3] Этот процесс использует тот факт, что одну бактериальную клетку можно заставить взять и реплицировать одну рекомбинантную молекулу ДНК. Затем эту одну клетку можно экспоненциально размножить для получения большого количества бактерий, каждая из которых содержит копии исходной рекомбинантной молекулы. Таким образом, как полученная бактериальная популяция, так и рекомбинантная молекула ДНК обычно называются «клонами». Строго говоря, рекомбинантная ДНК относится к молекулам ДНК, тогда как молекулярное клонирование относится к экспериментальным методам, используемым для их сборки. Возникла идея, что различные последовательности ДНК могут быть вставлены в плазмиду и что эти чужеродные последовательности будут переноситься в бактерии и перевариваться как часть плазмиды. То есть, эти плазмиды могут служить векторами клонирования для переноса генов. [4]
Практически любая последовательность ДНК может быть клонирована и амплифицирована, но есть некоторые факторы, которые могут ограничить успех процесса. Примерами последовательностей ДНК, которые трудно клонировать, являются инвертированные повторы, точки начала репликации, центромеры и теломеры. Также существует меньший шанс на успех при вставке больших последовательностей ДНК. Вставки размером более 10 кбн имеют очень ограниченный успех, но бактериофаги, такие как бактериофаг λ, могут быть модифицированы для успешной вставки последовательности размером до 40 кбн. [5]
До 1970-х годов понимание генетики и молекулярной биологии было серьезно затруднено невозможностью изолировать и изучать отдельные гены из сложных организмов. Это резко изменилось с появлением методов молекулярного клонирования. Микробиологи, стремясь понять молекулярные механизмы, посредством которых бактерии ограничивают рост бактериофага, выделили эндонуклеазы рестрикции , ферменты, которые могли расщеплять молекулы ДНК только при обнаружении определенных последовательностей ДНК. [6] Они показали, что ферменты рестрикции расщепляют молекулы ДНК длиной с хромосому в определенных местах, и что определенные участки более крупной молекулы можно очистить путем фракционирования по размеру. Используя второй фермент, ДНК-лигазу , фрагменты, полученные ферментами рестрикции, можно было объединить в новые комбинации, называемые рекомбинантной ДНК . Путем рекомбинации интересующих сегментов ДНК с векторной ДНК, такой как бактериофаг или плазмиды, которые естественным образом реплицируются внутри бактерий, в бактериальных культурах можно было производить большие количества очищенных рекомбинантных молекул ДНК. Первые рекомбинантные молекулы ДНК были созданы и изучены в 1972 году. [7] [8]
Молекулярное клонирование использует тот факт, что химическая структура ДНК в основе своей одинакова во всех живых организмах. Поэтому, если любой сегмент ДНК из любого организма вставить в сегмент ДНК, содержащий молекулярные последовательности, необходимые для репликации ДНК , и полученную рекомбинантную ДНК ввести в организм, из которого были получены последовательности репликации, то чужеродная ДНК будет реплицироваться вместе с ДНК клетки-хозяина в трансгенном организме.
Молекулярное клонирование похоже на ПЦР в том, что оно позволяет реплицировать последовательность ДНК. Фундаментальное различие между двумя методами заключается в том, что молекулярное клонирование подразумевает репликацию ДНК в живом микроорганизме, тогда как ПЦР реплицирует ДНК в растворе in vitro , свободном от живых клеток.
До проведения реальных экспериментов по клонированию в лаборатории большинство экспериментов по клонированию планируются на компьютере с использованием специализированного программного обеспечения. Хотя детальное планирование клонирования может быть выполнено в любом текстовом редакторе вместе с онлайн-утилитам, например, для проектирования праймеров ПЦР, для этой цели существует специальное программное обеспечение. Программное обеспечение для этой цели включает, например, ApE [1] (с открытым исходным кодом), DNAStrider [2] (с открытым исходным кодом), Serial Cloner [3] (бесплатно), Collagene [4] (с открытым исходным кодом) и SnapGene (коммерческое). Эти программы позволяют моделировать реакции ПЦР , рестрикционные переваривания , лигирования и т. д., то есть все шаги, описанные ниже.
В стандартных экспериментах по молекулярному клонированию клонирование любого фрагмента ДНК по сути включает семь этапов: (1) выбор организма-хозяина и вектора клонирования, (2) подготовка векторной ДНК, (3) подготовка ДНК для клонирования, (4) создание рекомбинантной ДНК, (5) введение рекомбинантной ДНК в организм-хозяин, (6) отбор организмов, содержащих рекомбинантную ДНК, (7) скрининг клонов с желаемыми вставками ДНК и биологическими свойствами.
Примечательно, что растущая емкость и точность платформ синтеза ДНК позволяет создавать все более сложные конструкции в молекулярной инженерии. Эти проекты могут включать очень длинные нити новой последовательности ДНК и/или тестировать целые библиотеки одновременно, в отличие от отдельных последовательностей. Эти сдвиги вносят сложность, которая требует от проектирования отхода от плоского представления на основе нуклеотидов и перехода к более высокому уровню абстракции. Примерами таких инструментов являются GenoCAD , Teselagen [5] (бесплатно для академических кругов) или GeneticConstructor [6] (бесплатно для академических кругов).
Хотя используется очень большое количество организмов-хозяев и молекулярных векторов клонирования, подавляющее большинство экспериментов по молекулярному клонированию начинаются с лабораторного штамма бактерии E. coli ( Escherichia coli ) и плазмидного вектора клонирования . E. coli и плазмидные векторы широко используются, поскольку они технически сложны, универсальны, широко доступны и обеспечивают быстрый рост рекомбинантных организмов с минимальным оборудованием. [3] Если клонируемая ДНК исключительно велика (сотни тысяч или миллионы пар оснований), то часто выбирают бактериальную искусственную хромосому [10] или вектор искусственной хромосомы дрожжей .
Специализированные приложения могут потребовать специализированных систем хозяин-вектор. Например, если экспериментаторы хотят собрать определенный белок из рекомбинантного организма, то выбирается вектор экспрессии , который содержит соответствующие сигналы для транскрипции и трансляции в желаемом организме-хозяине. В качестве альтернативы, если желательна репликация ДНК в разных видах (например, перенос ДНК от бактерий к растениям), то может быть выбран вектор с множественным диапазоном хозяев (также называемый челночным вектором ). На практике, однако, специализированные эксперименты по молекулярному клонированию обычно начинаются с клонирования в бактериальную плазмиду, за которым следует субклонирование в специализированный вектор.
Какая бы комбинация хозяина и вектора ни использовалась, вектор почти всегда содержит четыре сегмента ДНК, которые критически важны для его функции и экспериментальной полезности: [3]
Вектор клонирования обрабатывается эндонуклеазой рестрикции для расщепления ДНК в месте, куда будет вставлена чужеродная ДНК. Фермент рестрикции выбирается для создания конфигурации в месте расщепления, которая совместима с концами чужеродной ДНК (см. Конец ДНК ). Обычно это делается путем расщепления векторной ДНК и чужеродной ДНК одним и тем же ферментом рестрикции или эндонуклеазой рестрикции, например EcoRI , и этот фермент рестрикции был выделен из E.coli. [11] Большинство современных векторов содержат множество удобных сайтов расщепления, которые являются уникальными в пределах векторной молекулы (так что вектор может быть расщеплен только в одном месте) и расположены внутри гена (часто бета-галактозидазы ), инактивация которого может использоваться для различения рекомбинантных и нерекомбинантных организмов на более позднем этапе процесса. Чтобы улучшить соотношение рекомбинантных и нерекомбинантных организмов, расщепленный вектор можно обработать ферментом ( щелочной фосфатазой ), который дефосфорилирует концы вектора. Векторные молекулы с дефосфорилированными концами не способны реплицироваться, и репликация может быть восстановлена только в том случае, если чужеродная ДНК интегрируется в сайт расщепления. [12]
Для клонирования геномной ДНК клонируемая ДНК извлекается из интересующего организма. Можно использовать практически любой источник ткани (даже ткани вымерших животных ), [13] при условии, что ДНК не сильно деградировала. Затем ДНК очищается с помощью простых методов удаления загрязняющих белков (экстракция фенолом), РНК (рибонуклеаза) и более мелких молекул (осаждение и/или хроматография). Методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) часто используются для амплификации определенных последовательностей ДНК или РНК ( ОТ-ПЦР ) перед молекулярным клонированием.
ДНК для экспериментов по клонированию может быть также получена из РНК с использованием обратной транскриптазы ( комплементарное клонирование ДНК или кДНК) или в форме синтетической ДНК ( искусственный синтез генов ). Клонирование кДНК обычно используется для получения клонов, представляющих популяцию мРНК интересующих клеток, в то время как синтетическая ДНК используется для получения любой точной последовательности, определенной дизайнером. Такая разработанная последовательность может потребоваться при перемещении генов через генетические коды (например, из митохондрий в ядро) [14] или просто для увеличения экспрессии посредством оптимизации кодонов . [15]
Очищенная ДНК затем обрабатывается рестриктазой для получения фрагментов с концами, способными связываться с концами вектора. При необходимости можно добавлять короткие двухцепочечные сегменты ДНК ( линкеры ), содержащие желаемые сайты рестрикции, для создания конечных структур, совместимых с вектором. [3] [12]
Создание рекомбинантной ДНК во многих отношениях является самым простым этапом процесса молекулярного клонирования. ДНК, полученная из вектора и чужеродного источника, просто смешивается в соответствующих концентрациях и подвергается воздействию фермента ( ДНК-лигазы ), который ковалентно связывает концы вместе. Эту реакцию соединения часто называют лигированием . Полученная смесь ДНК, содержащая случайно соединенные концы, затем готова к введению в организм хозяина.
ДНК-лигаза распознает и действует только на концы линейных молекул ДНК, что обычно приводит к сложной смеси молекул ДНК со случайно соединенными концами. Желаемые продукты (векторная ДНК, ковалентно связанная с чужеродной ДНК) будут присутствовать, но другие последовательности (например, чужеродная ДНК, связанная сама с собой, векторная ДНК, связанная сама с собой, и комбинации векторной и чужеродной ДНК более высокого порядка) также обычно присутствуют. Эта сложная смесь сортируется на последующих этапах процесса клонирования, после того как смесь ДНК вводится в клетки. [3] [12]
Смесь ДНК, ранее обработанная in vitro, возвращается в живую клетку, называемую организмом-хозяином. Методы, используемые для введения ДНК в клетки, разнообразны, и название, применяемое к этому этапу в процессе молекулярного клонирования, часто зависит от выбранного экспериментального метода (например, трансформация , трансдукция , трансфекция , электропорация ). [3] [12]
Когда микроорганизмы способны поглощать и реплицировать ДНК из своей локальной среды, этот процесс называется трансформацией , а клетки, которые находятся в таком физиологическом состоянии, что могут поглощать ДНК, называются компетентными . [16] В культуре клеток млекопитающих аналогичный процесс введения ДНК в клетки обычно называется трансфекцией . Как трансформация, так и трансфекция обычно требуют подготовки клеток с помощью специального режима роста и процесса химической обработки, которые будут различаться в зависимости от конкретных видов и типов используемых клеток.
Электропорация использует электрические импульсы высокого напряжения для перемещения ДНК через клеточную мембрану (и клеточную стенку, если таковая имеется). [17] Напротив, трансдукция включает упаковку ДНК в вирусные частицы и использование этих вирусоподобных частиц для введения инкапсулированной ДНК в клетку посредством процесса, напоминающего вирусную инфекцию. Хотя электропорация и трансдукция являются узкоспециализированными методами, они могут быть наиболее эффективными методами перемещения ДНК в клетки.
Какой бы метод ни использовался, введение рекомбинантной ДНК в выбранный организм-хозяин обычно является процессом с низкой эффективностью; то есть только небольшая часть клеток фактически примет ДНК. Экспериментальные ученые решают эту проблему посредством этапа искусственного генетического отбора, в котором клетки, не принявшие ДНК, выборочно убиваются, и только те клетки, которые могут активно реплицировать ДНК, содержащую ген селективного маркера, кодируемый вектором, способны выжить. [3] [12]
Когда в качестве организмов-хозяев используются бактериальные клетки, селективным маркером обычно является ген, который придает устойчивость к антибиотику , который в противном случае убил бы клетки, обычно ампициллину . Клетки, несущие плазмиду, выживут при воздействии антибиотика, в то время как те, которые не смогли принять плазмидные последовательности, погибнут. Когда используются клетки млекопитающих (например, клетки человека или мыши), применяется аналогичная стратегия, за исключением того, что ген-маркер (в этом случае обычно кодируемый как часть кассеты kanMX ) придает устойчивость к антибиотику Geneticin .
Современные бактериальные векторы клонирования (например, pUC19 и более поздние производные, включая векторы pGEM) используют систему сине-белого скрининга для различения колоний (клонов) трансгенных клеток от тех, которые содержат родительский вектор (т. е. векторную ДНК без вставленной рекомбинантной последовательности). В этих векторах чужеродная ДНК вставляется в последовательность, которая кодирует существенную часть бета-галактозидазы , фермента, активность которого приводит к образованию колонии синего цвета на питательной среде, которая используется для этой работы. Вставка чужеродной ДНК в кодирующую последовательность бета-галактозидазы отключает функцию фермента, так что колонии, содержащие трансформированную ДНК, остаются бесцветными (белыми). Поэтому экспериментаторы могут легко идентифицировать и проводить дальнейшие исследования трансгенных бактериальных клонов, игнорируя те, которые не содержат рекомбинантной ДНК.
Общая популяция отдельных клонов, полученных в ходе эксперимента по молекулярному клонированию, часто называется библиотекой ДНК . Библиотеки могут быть очень сложными (например, при клонировании полной геномной ДНК из организма) или относительно простыми (например, при перемещении ранее клонированного фрагмента ДНК в другую плазмиду), но почти всегда необходимо исследовать несколько различных клонов, чтобы убедиться, что получена желаемая конструкция ДНК. Это может быть достигнуто с помощью очень широкого спектра экспериментальных методов, включая использование гибридизации нуклеиновых кислот , зондов антител , полимеразной цепной реакции , анализа рестрикционных фрагментов и/или секвенирования ДНК . [3] [12]
Молекулярное клонирование предоставляет ученым практически неограниченное количество любых отдельных сегментов ДНК, полученных из любого генома. Этот материал может быть использован для широкого спектра целей, включая как фундаментальные, так и прикладные биологические науки. Некоторые из наиболее важных приложений суммированы здесь.
Молекулярное клонирование напрямую привело к выяснению полной последовательности ДНК геномов очень большого числа видов и к исследованию генетического разнообразия внутри отдельных видов. Эта работа была проделана в основном путем определения последовательности ДНК большого количества случайно клонированных фрагментов генома и сборки перекрывающихся последовательностей.
На уровне отдельных генов молекулярные клоны используются для создания зондов , которые используются для изучения того, как гены экспрессируются , и как эта экспрессия связана с другими процессами в биологии, включая метаболическую среду, внеклеточные сигналы, развитие, обучение, старение и гибель клеток. Клонированные гены также могут предоставить инструменты для изучения биологической функции и важности отдельных генов, позволяя исследователям инактивировать гены или производить более тонкие мутации с помощью регионального мутагенеза или сайт-направленного мутагенеза . Гены, клонированные в векторы экспрессии для функционального клонирования, предоставляют средства для скрининга генов на основе функции экспрессируемого белка.
Получение молекулярного клона гена может привести к разработке организмов, которые производят белковый продукт клонированных генов, называемый рекомбинантным белком. На практике часто бывает сложнее разработать организм, который производит активную форму рекомбинантного белка в желаемых количествах, чем клонировать ген. Это происходит потому, что молекулярные сигналы для экспрессии гена сложны и изменчивы, а также потому, что сворачивание, стабильность и транспортировка белка могут быть очень сложными.
В настоящее время доступно множество полезных белков в виде рекомбинантных продуктов . К ним относятся: (1) полезные с медицинской точки зрения белки, введение которых может исправить дефектный или плохо выраженный ген (например, рекомбинантный фактор VIII , фактор свертывания крови, дефицитный при некоторых формах гемофилии , [18] и рекомбинантный инсулин , используемый для лечения некоторых форм диабета [19] ), (2) белки, которые можно вводить для оказания помощи в чрезвычайных ситуациях, угрожающих жизни (например, тканевой активатор плазминогена , используемый для лечения инсультов [20] ), (3) рекомбинантные субъединичные вакцины, в которых очищенный белок можно использовать для иммунизации пациентов против инфекционных заболеваний, не подвергая их воздействию самого инфекционного агента (например, вакцина против гепатита B [21] ), и (4) рекомбинантные белки как стандартный материал для диагностических лабораторных тестов.
После характеристики и манипуляции с целью обеспечения сигналов для соответствующей экспрессии клонированные гены могут быть вставлены в организмы, создавая трансгенные организмы, также называемые генетически модифицированными организмами (ГМО). Хотя большинство ГМО создаются для целей фундаментальных биологических исследований (см., например, трансгенную мышь ), ряд ГМО были разработаны для коммерческого использования, начиная от животных и растений, которые производят фармацевтические препараты или другие соединения ( фарминг ), устойчивых к гербицидам сельскохозяйственных культур и флуоресцентных тропических рыб ( GloFish ) для домашнего развлечения. [1]
Генная терапия подразумевает поставку функционального гена в клетки, лишенные этой функции, с целью исправления генетического нарушения или приобретенного заболевания. Генную терапию можно в целом разделить на две категории. Первая — это изменение зародышевых клеток, то есть спермы или яйцеклеток, что приводит к постоянному генетическому изменению для всего организма и последующих поколений. Такая «генная терапия зародышевой линии» многими считается неэтичной для людей. [22] Второй тип генной терапии, «генная терапия соматических клеток», аналогичен трансплантации органов. В этом случае одна или несколько конкретных тканей подвергаются прямому лечению или удалению ткани, добавлению терапевтического гена или генов в лаборатории и возвращению обработанных клеток пациенту. Клинические испытания генной терапии соматических клеток начались в конце 1990-х годов, в основном для лечения рака и заболеваний крови, печени и легких. [23]
Несмотря на большую рекламу и обещания, история генной терапии человека характеризуется относительно ограниченным успехом. [23] Эффект введения гена в клетки часто способствует лишь частичному и/или временному облегчению симптомов заболевания, подлежащего лечению. Некоторые пациенты, проходящие испытания генной терапии, страдали от неблагоприятных последствий самого лечения, включая смерть. В некоторых случаях неблагоприятные эффекты возникают из-за нарушения основных генов в геноме пациента путем инсерционной инактивации. В других случаях вирусные векторы, используемые для генной терапии, были заражены инфекционным вирусом. Тем не менее, генная терапия по-прежнему считается перспективной областью медицины будущего и является областью, где наблюдается значительный уровень научно-исследовательской и опытно-конструкторской деятельности.
Медиа, связанные с Молекулярное клонирование на Wikimedia Commons