Люцифераза — это общее название класса окислительных ферментов , которые производят биолюминесценцию , и обычно отличается от фотопротеина . Название было впервые использовано Рафаэлем Дюбуа , который придумал слова люциферин и люцифераза для субстрата и фермента соответственно. [1] Оба слова происходят от латинского слова lucifer , означающего «носитель света», которое, в свою очередь, происходит от латинских слов «свет» ( lux) и «приносить или нести» ( ferre) . [2]
Люциферазы широко используются в биотехнологии , для биолюминесцентной визуализации [3] микроскопии и в качестве репортерных генов , для многих из тех же приложений, что и флуоресцентные белки . Однако, в отличие от флуоресцентных белков, люциферазы не требуют внешнего источника света , но требуют добавления люциферина , потребляемого субстрата.
Различные организмы регулируют свою светопродукцию с помощью различных люцифераз в различных реакциях испускания света. Большинство изученных люцифераз были обнаружены у животных, включая светлячков [ 4] и многих морских животных, таких как веслоногие рачки , медузы и морские анютины глазки . Однако люциферазы были изучены у светящихся грибов, таких как гриб Джек-О-Лантерн , а также у примеров из других царств, включая биолюминесцентные бактерии и динофлагелляты .
Люциферазы светлячков , которых насчитывается более 2000 видов , и других Elateroidea (щелкунов и родственников в целом) достаточно разнообразны, чтобы быть полезными в молекулярной филогении . [5] У светлячков необходимый кислород поступает через трубку в брюшной полости, называемую брюшной трахеей . Одной из хорошо изученных люцифераз является люцифераза светлячка Photinini Photinus pyralis , которая имеет оптимальный pH 7,8. [6]
Также хорошо изучен морской фиалковый глазок , Renilla reniformis . В этом организме люцифераза ( Renilla-luciferin 2-monooxygenase ) тесно связана с люциферин-связывающим белком, а также с зеленым флуоресцентным белком ( GFP ). Кальций запускает высвобождение люциферина ( целентеразина ) из люциферин-связывающего белка. Затем субстрат становится доступным для окисления люциферазой, где он расщепляется до целентерамида с последующим высвобождением энергии. В отсутствие GFP эта энергия высвобождалась бы в виде фотона синего света (пиковая длина волны излучения 482 нм). Однако из-за тесно связанного GFP энергия, высвобождаемая люциферазой, вместо этого связана посредством резонансной передачи энергии на флуорофор GFP и впоследствии высвобождается в виде фотона зеленого света (пиковая длина волны излучения 510 нм). Катализируемая реакция выглядит следующим образом: [7]
Недавно были идентифицированы новые люциферазы, которые, в отличие от других люцифераз, являются естественными секретируемыми молекулами. Одним из таких примеров является люцифераза Metridia coelenterazine -зависимая (MetLuc, A0A1L6CBM1 ), которая получена из морского веслоногого рачка Metridia longa . Ген секретируемой люциферазы Metridia longa кодирует белок массой 24 кДа, содержащий N-концевой секреторный сигнальный пептид из 17 аминокислотных остатков. Чувствительность и высокая интенсивность сигнала этой молекулы люциферазы оказываются выгодными во многих исследованиях репортеров. Одним из преимуществ использования секретируемой репортерной молекулы, такой как MetLuc, является ее протокол без лизиса, который позволяет проводить анализы живых клеток и множественные анализы на одной и той же клетке. [8]
Бактериальная биолюминесценция наблюдается у видов Photobacterium, Vibrio fischeri , Vibrio haweyi и Vibrio harveyi . Световое излучение некоторых биолюминесцентных бактерий использует «антенну», такую как белок люмазин, для приема энергии из первичного возбужденного состояния люциферазы, что приводит к возбужденному хромофору люлназина , который излучает свет с более короткой длиной волны (более синий), в то время как другие используют желтый флуоресцентный белок (YFP) с флавинмононуклеотидом (FMN) в качестве хромофора и излучают свет, смещенный в красную сторону относительно света люциферазы. [9]
Динофлагеллятная люцифераза — это многодоменный белок эукариот , состоящий из N-концевого домена и трех каталитических доменов , каждому из которых предшествует домен спирального пучка. Структура каталитического домена динофлагеллятной люциферазы была решена. [10] Основная часть домена представляет собой 10-цепочечный бета-бочонок , который структурно похож на липокалины и FABP . [10] N-концевой домен сохраняется между динофлагеллятной люциферазой и люциферин- связывающими белками (LBP). Было высказано предположение, что эта область может опосредовать взаимодействие между LBP и люциферазой или их ассоциацию с вакуолярной мембраной. [11] Домен спирального пучка имеет трехспиральную структуру пучка , которая содержит четыре важных гистидина, которые , как полагают, играют роль в регуляции pH фермента . [10] При pH 8 в β-стволе динофлагеллятной люциферазы имеется большой карман для размещения тетрапиррольного субстрата, но нет отверстия, позволяющего субстрату войти. Следовательно, должно произойти значительное конформационное изменение, чтобы обеспечить доступ и пространство для лиганда в активном центре, и источником этого изменения являются четыре N-концевых остатка гистидина. [10] При pH 8 можно увидеть, что непротонированные остатки гистидина вовлечены в сеть водородных связей на границе спиралей в пучке, которые блокируют доступ субстрата к активному центру , и нарушение этого взаимодействия протонированием (при pH 6,3) или заменой остатков гистидина аланином вызывает большое молекулярное движение пучка, разделяя спирали на 11Å и открывая каталитический сайт. [10] Логично, что остатки гистидина не могут быть заменены аланином в природе, но эта экспериментальная замена дополнительно подтверждает, что более крупные остатки гистидина блокируют активный сайт. Кроме того, три последовательности Gly-Gly, одна в N-концевой спирали и две в мотиве спираль-петля-спираль, могут служить шарнирами, вокруг которых вращаются цепи, чтобы еще больше открыть путь к каталитическому сайту и увеличить активный сайт. [10]
Люцифераза динофлагеллят способна излучать свет благодаря взаимодействию со своим субстратом ( люциферином ) и люциферин-связывающим белком (LBP) в сцинтиллоновой органелле, обнаруженной у динофлагеллят. [10] Люцифераза действует в соответствии с люциферином и LBP, чтобы излучать свет, но каждый компонент функционирует при разном pH. Люцифераза и ее домены неактивны при pH 8, но они чрезвычайно активны при оптимальном pH 6,3, тогда как LBP связывает люциферин при pH 8 и высвобождает его при pH 6,3. [10] Следовательно, люциферин высвобождается для реакции с активной люциферазой только тогда, когда сцинтиллон подкисляется до pH 6,3. Поэтому для снижения pH открываются потенциалзависимые каналы в мембране сцинтиллона, чтобы обеспечить проникновение протонов из вакуоли , обладающей потенциалом действия, полученным при механической стимуляции. [10] Таким образом, можно увидеть, что потенциал действия в вакуолярной мембране приводит к закислению, а это, в свою очередь, позволяет люциферину высвобождаться для реакции с люциферазой в сцинтиллоне, производя вспышку синего света.
Все люциферазы классифицируются как оксидоредуктазы ( EC 1.13.12.-), что означает, что они действуют на отдельных донорах с включением молекулярного кислорода. Поскольку люциферазы происходят из многих различных семейств белков , которые не связаны между собой, не существует единого механизма, поскольку любой механизм зависит от комбинации люциферазы и люциферина. Однако было показано, что все охарактеризованные реакции люциферазы-люциферина на сегодняшний день требуют молекулярного кислорода на определенном этапе.
Реакция, катализируемая бактериальной люциферазой, также является окислительным процессом:
В реакции молекулярный кислород окисляет флавинмононуклеотид и длинноцепочечный алифатический альдегид до алифатической карбоновой кислоты . Реакция образует возбужденный гидроксифлавиновый интермедиат, который дегидратируется до продукта FMN, испуская сине-зеленый свет. [12]
Почти вся энергия, поступающая в реакцию, преобразуется в свет. Реакция имеет эффективность от 80% [13] до 90% [14] . Для сравнения, лампа накаливания преобразует в свет только около 10% своей энергии [15] , а светодиод с яркостью 150 люмен на ватт (лм/Вт) преобразует 20% входящей энергии в видимый свет. [14]
Люциферазы могут быть получены в лаборатории с помощью генной инженерии для ряда целей. Гены люциферазы могут быть синтезированы и вставлены в организмы или трансфицированы в клетки. По состоянию на 2002 год, мыши , шелкопряды и картофель — это лишь некоторые из организмов, которые уже были сконструированы для производства этого белка. [16]
В реакции люциферазы свет испускается, когда люцифераза воздействует на соответствующий субстрат люциферина . Эмиссия фотонов может быть обнаружена светочувствительным прибором, таким как люминометр или оптический микроскоп с ПЗС-камерой . Это позволяет наблюдать биологические процессы. [17] Поскольку для биолюминесценции люциферазы не требуется световое возбуждение, автофлуоресценция минимальна , и поэтому биолюминесцентный сигнал практически не имеет фона. [18] Таким образом, даже 0,02 пг можно точно измерить с помощью стандартного сцинтилляционного счетчика . [19]
В биологических исследованиях люцифераза обычно используется в качестве репортера для оценки транскрипционной активности в клетках, трансфицированных генетической конструкцией, содержащей ген люциферазы под контролем интересующего промотора . [20] Кроме того, пролюминесцентные молекулы, которые преобразуются в люциферин при активности определенного фермента, могут использоваться для обнаружения активности фермента в сопряженных или двухэтапных анализах люциферазы. Такие субстраты использовались для обнаружения активности каспазы и активности цитохрома P450 , среди прочего. [17] [20]
Люцифераза также может использоваться для определения уровня клеточного АТФ в анализах жизнеспособности клеток или для анализов активности киназы. [20] [21] Люцифераза может действовать как белок-сенсор АТФ посредством биотинилирования . Биотинилирование иммобилизует люциферазу на поверхности клетки путем связывания с комплексом стрептавидин - биотин . Это позволяет люциферазе определять отток АТФ из клетки и эффективно отображать высвобождение АТФ в реальном времени посредством биолюминесценции. [22] Люциферазу можно дополнительно сделать более чувствительной для обнаружения АТФ путем увеличения интенсивности люминесценции путем изменения определенных аминокислотных остатков в последовательности белка. [23]
Визуализация всего организма (называемая in vivo, когда она не повреждена, или, иначе называемая ex vivo визуализацией, например, живой, но эксплантированной ткани) является мощным методом изучения популяций клеток в живых растениях или животных, таких как мыши. [24] Различные типы клеток (например, стволовые клетки костного мозга, Т-клетки) могут быть сконструированы для экспрессии люциферазы, что позволяет проводить их неинвазивную визуализацию внутри живого животного с использованием чувствительной камеры с зарядовой парой ( CCD-камеры ). Этот метод использовался для отслеживания опухолегенеза и реакции опухолей на лечение в моделях животных. [25] [26] Однако факторы окружающей среды и терапевтические вмешательства могут вызывать некоторые расхождения между опухолевой нагрузкой и интенсивностью биолюминесценции в связи с изменениями пролиферативной активности. Интенсивность сигнала, измеренного с помощью визуализации in vivo, может зависеть от различных факторов, таких как абсорбция D -люциферина через брюшину, кровоток, проницаемость клеточной мембраны, наличие сопутствующих факторов, внутриклеточный pH и прозрачность вышележащей ткани, а также от количества люциферазы. [27]
Люцифераза — это термочувствительный белок, который используется в исследованиях по денатурации белков , тестируя защитные возможности белков теплового шока . Возможности использования люциферазы продолжают расширяться. [28]
Медиа, связанные с Люциферазой на Wikimedia Commons