stringtranslate.com

Дополнительная ДНК

Результаты микрочипа кДНК , использованного при тестировании

В генетике комплементарная ДНК ( кДНК ) — это ДНК , которая была обратно транскрибирована (посредством обратной транскриптазы ) с РНК (например, информационной РНК или микроРНК ). кДНК существует как в одноцепочечной , так и в двухцепочечной формах, а также в природной и сконструированной формах.

В сконструированных формах это часто копия (реплика) встречающейся в природе ДНК из естественного генома какого-либо конкретного организма; собственная мРНК организма естественным образом транскрибируется с его ДНК, а кДНК подвергается обратной транскрипции с мРНК, в результате чего образуется дубликат исходной ДНК. Сконструированная кДНК часто используется для экспрессии определенного белка в клетке, которая обычно не экспрессирует этот белок (т.е. гетерологичная экспрессия), или для секвенирования или количественного определения молекул мРНК с использованием методов на основе ДНК (qPCR, RNA-seq). кДНК, кодирующая определенный белок, может быть перенесена в клетку-реципиент для экспрессии как часть рекомбинантной ДНК , часто бактериальной или дрожжевой системы экспрессии. [1] кДНК также генерируется для анализа транскриптомных профилей в объемных тканях, отдельных клетках или отдельных ядрах в таких анализах, как микрочипы , qPCR и RNA-seq .

В естественных формах кДНК вырабатывается ретровирусами (такими как ВИЧ-1 , ВИЧ-2 , вирус иммунодефицита обезьян и т. д.), а затем интегрируется в геном хозяина, где создает провирус . [2]

Термин кДНК также используется, обычно в контексте биоинформатики , для обозначения последовательности транскрипта мРНК, выраженной в виде оснований ДНК (дезокси-GCAT), а не оснований РНК (GCAU).

Патентоспособность кДНК была предметом решения Верховного суда США в 2013 году по делу Ассоциация молекулярной патологии против Myriad Genetics, Inc. В качестве компромисса суд заявил, что кДНК, состоящая только из экзонов , подлежит патентованию, тогда как изолированные последовательности ДНК природного происхождения содержащие интроны, таковыми не являются.

Синтез

РНК служит матрицей для синтеза кДНК. [3] В клеточной жизни кДНК генерируется вирусами и ретротранспозонами для интеграции РНК в целевую геномную ДНК . В молекулярной биологии РНК очищают из исходного материала после удаления геномной ДНК, белков и других клеточных компонентов. кДНК затем синтезируется посредством обратной транскрипции in vitro . [4]

очистка РНК

РНК транскрибируется из геномной ДНК в клетках-хозяевах и экстрагируется путем сначала лизиса клеток, а затем очистки РНК с использованием широко используемых методов, таких как фенол-хлороформ, колонка с диоксидом кремния и методы экстракции РНК на основе шариков. [5] Методы экстракции различаются в зависимости от исходного материала. Например, экстракция РНК из растительной ткани требует дополнительных реагентов, таких как поливинилпирролидон (ПВП), для удаления фенольных соединений, углеводов и других соединений, которые в противном случае сделают РНК непригодной для использования. [6] Для удаления ДНК и белков для деградации используются такие ферменты, как ДНКаза и протеиназа К. [7] Важно отметить, что целостность РНК поддерживается путем инактивации РНКаз с помощью хаотропных агентов, таких как изотиоцианат гуанидиния, додецилсульфат натрия (SDS), фенол или хлороформ. Затем тотальную РНК отделяют от других клеточных компонентов и осаждают спиртом. Существуют различные коммерческие наборы для простого и быстрого выделения РНК для конкретных применений. [8] Дополнительные методы на основе шариков могут быть использованы для выделения конкретных подтипов РНК (например, мРНК и микроРНК ) в зависимости от размера или уникальных участков РНК. [9] [10]

Обратная транскрипция

Синтез первой цепи

Используя фермент обратной транскриптазы и очищенные матрицы РНК, получают одну цепь кДНК (синтез первой цепи кДНК). Обратная транскриптаза M-MLV из вируса мышиного лейкоза Молони обычно используется из-за ее пониженной активности РНКазы H, подходящей для транскрипции более длинных РНК. [11] Обратная транскриптаза AMV из вируса птичьего миелобластоза также может быть использована для матриц РНК с сильными вторичными структурами (т.е. с высокой температурой плавления). [12] кДНК обычно получают из мРНК для анализа экспрессии генов, такого как RT-qPCR и RNA-seq . [13] мРНК избирательно обратно транскрибируется с использованием олиго-d Т- праймеров, которые являются обратным комплементом полиаденилированного хвоста на 3'-конце всей мРНК. Праймер олиго-dT отжигается с полиаденилированным хвостом мРНК и служит местом связывания обратной транскриптазы для начала обратной транскрипции. Оптимизированная смесь олиго-дТ и случайных гексамерных праймеров увеличивает вероятность получения полноразмерной кДНК, одновременно уменьшая 5'- или 3'-систематическую ошибку. [14] Рибосомальная РНК также может быть истощена для обогащения как мРНК, так и неполиаденилированных транскриптов, таких как некоторые некодирующие РНК . [15]

Синтез второй цепи

Результат синтеза первой цепи, гибриды РНК-ДНК, можно обрабатывать с помощью нескольких методов синтеза второй цепи или обрабатывать непосредственно в последующих анализах. [16] [17] Ранний метод, известный как синтез со шпилькой, основывался на образовании шпильки на 3'-конце кДНК первой цепи для запуска синтеза второй цепи. Однако прайминг носит случайный характер, и гидролиз шпилек приводит к потере информации. Процедура Гублера и Хоффмана использует РНКазу H E. Coli для разрыва мРНК, которая заменяется ДНК-полимеразой I E. Coli и запечатывается ДНК-лигазой E. Coli . Оптимизация этой процедуры основана на низкой активности РНКазы H MLV для разрыва мРНК, а оставшаяся РНК позже удаляется путем добавления РНКазы H после трансляции ДНК-полимеразы второй цепи кДНК. Это предотвращает потерю информации о последовательности на 5'-конце мРНК.

Приложения

Комплементарная ДНК часто используется при клонировании генов , в качестве генных зондов или при создании библиотеки кДНК . Когда ученые переносят ген из одной клетки в другую, чтобы экспрессировать новый генетический материал в виде белка в клетке-реципиенте, к реципиенту будет добавлена ​​кДНК (а не весь ген), поскольку ДНК для всего гена может включать ДНК, которая не кодирует белок или прерывает кодирующую последовательность белка (например, интроны ). Частичные последовательности кДНК часто получают в виде меток экспрессируемых последовательностей .

Поскольку амплификация последовательностей ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) сейчас стала обычным явлением, на начальном этапе обычно проводят обратную транскрипцию с последующей ПЦР для получения точной последовательности кДНК для внутриклеточной экспрессии. Это достигается путем создания специфичных для последовательности праймеров ДНК, которые гибридизуются с 5'- и 3'-концами участка кДНК, кодирующего белок. После амплификации последовательность можно разрезать на каждом конце с помощью нуклеаз и вставить в одну из множества небольших кольцевых последовательностей ДНК, известных как векторы экспрессии. Такие векторы обеспечивают саморепликацию внутри клеток и потенциально интеграцию в ДНК хозяина. Обычно они также содержат сильный промотор, который управляет транскрипцией целевой кДНК в мРНК, которая затем транслируется в белок.

кДНК также используется для изучения экспрессии генов с помощью таких методов, как RNA-seq или RT-qPCR . [18] [19] [20] Для секвенирования РНК должна быть фрагментирована из-за ограничений размера платформы секвенирования. Кроме того, синтезированную вторую цепь кДНК необходимо лигировать с адаптерами, которые позволяют фрагментам кДНК амплифицироваться с помощью ПЦР и связываться с проточными клетками для секвенирования. В методах ген-специфического анализа обычно используются микрочипы и RT-qPCR для количественного определения уровней кДНК с помощью флуорометрических и других методов.

13 июня 2013 года Верховный суд США постановил по делу Ассоциация молекулярной патологии против Myriad Genetics, что, хотя встречающиеся в природе гены не могут быть запатентованы , кДНК подлежит патентованию, поскольку она не встречается в природе. [21]

Вирусы и ретротранспозоны

Некоторые вирусы также используют кДНК для превращения своей вирусной РНК в мРНК (вирусная РНК → кДНК → мРНК). мРНК используется для того, чтобы вирусные белки захватили клетку-хозяина.

Пример этого первого шага от вирусной РНК к кДНК можно увидеть в цикле заражения ВИЧ. Здесь мембрана клетки-хозяина прикрепляется к липидной оболочке вируса, что позволяет вирусному капсиду с двумя копиями РНК вирусного генома проникнуть в хозяина. Копия кДНК затем создается посредством обратной транскрипции вирусной РНК - процесса, которому способствуют шаперон CypA и обратная транскриптаза, связанная с вирусным капсидом. [22]

кДНК также генерируется ретротранспозонами в геномах эукариот. Ретротранспозоны — это мобильные генетические элементы, которые перемещаются внутри, а иногда и между геномами через промежуточные РНК. Этот механизм является общим с вирусами, за исключением образования инфекционных частиц. [23] [24]

Смотрите также

Рекомендации

Марк Д. Адамс и др. «Дополнительное секвенирование ДНК: метки выраженных последовательностей и проект генома человека». Наука (Американская ассоциация содействия развитию науки) 252.5013 (1991): 1651–1656. Веб.

Филип М. Мерфи и Х. Ли Тиффани. «Клонирование дополнительной ДНК, кодирующей функциональный рецептор интерлейкина-8 человека». Наука (Американская ассоциация содействия развитию науки) 253.5025 (1991): 1280–1283. Веб.

  1. ^ Гастингс, П.Дж. (1 января 2001 г.), «Комплементарная ДНК (кДНК)», в Бреннере, Сидней; Миллер, Джеффри Х. (ред.), Энциклопедия генетики , Нью-Йорк: Academic Press, стр. 433, ISBN 978-0-12-227080-2, получено 29 ноября 2022 г.
  2. ^ Крой, Рон. «Молекулярная генетика II - Курс генной инженерии (дополнительные примечания)». Даремский университет durham.ac.uk; 20 апреля 1998 года . Архивировано из оригинала 24 августа 2002 года . Проверено 4 февраля 2015 г.
  3. ↑ Ин, Шао-Яо (1 июля 2004 г.). «Дополнительные библиотеки ДНК». Молекулярная биотехнология . 27 (3): 245–252. дои : 10.1385/МБ: 27:3:245. ISSN  1559-0305. PMID  15247497. S2CID  25600775.
  4. ^ «5 шагов к оптимальному синтезу кДНК - США» . www.thermofisher.com . Проверено 12 мая 2020 г.
  5. ^ Таварес, Луселия; Алвес, Паула М.; Феррейра, Рикардо Б.; Сантос, Клаудия Н. (6 января 2011 г.). «Сравнение различных методов выделения РНК без ДНК из нейробластомы SK-N-MC». Исследовательские заметки BMC . 4 (1): 3. дои : 10.1186/1756-0500-4-3 . ISSN  1756-0500. ПМК 3050700 . ПМИД  21211020. 
  6. ^ Р, Кансал; К, Кухар; Я, Верма; Рн, Гупта; Вк, Гупта; Кр, Кундал (декабрь 2008 г.). «Улучшенный и удобный метод выделения РНК из полифенолов и богатых полисахаридами растительных тканей». Индийский журнал экспериментальной биологии . 46 (12): 842–5. ПМИД  19245182.
  7. ^ Я, Вомелова; З, Ваницкова; А, Седо (2009). «Методы очистки РНК. Все пути (должны) вести в Рим». Фолиа биологическая . 55 (6): 243–51. ПМИД  20163774.
  8. ^ Селлин Джеффрис, Марло К.; Поцелуй, Андор Дж.; Смит, Остин В.; Орис, Джеймс Т. (14 ноября 2014 г.). «Сравнение коммерчески доступных наборов для автоматической и ручной экстракции для выделения тотальной РНК из небольших образцов тканей». БМК Биотехнология . 14 (1): 94. дои : 10.1186/s12896-014-0094-8 . ISSN  1472-6750. ПМЦ 4239376 . ПМИД  25394494. 
  9. ^ «Выделение мРНК с помощью Dynabeads за 15 минут - США» . www.thermofisher.com . Проверено 20 мая 2020 г.
  10. ^ Гаарц, Андреа; Дебей-Пашер, Свенья; Классен, Сабина; Эггл, Даниэла; Гатхоф, Биргит; Чен, Цзин; Фань, Цзянь-Бин; Восс, Торстен; Шульце, Иоахим Л.; Старачек-Йокс, Андреа (май 2010 г.). «Профилирование экспрессии микроРНК в периферической крови на основе Bead Array и влияние различных подходов к выделению РНК». Журнал молекулярной диагностики . 12 (3): 335–344. doi : 10.2353/jmoldx.2010.090116. ISSN  1525-1578. ПМК 2860470 . ПМИД  20228267. 
  11. ^ Хаддад, Фадия; Болдуин, Кеннет М. (2010), Кинг, Никола (ред.), «Обратная транскрипция рибонуклеиновой кислоты: первый шаг в анализе RT-PCR», Протоколы RT-PCR: второе издание , Methods in Molecular Biology, vol. 630, Humana Press, стр. 261–270, номер документа : 10.1007/978-1-60761-629-0_17, ISBN. 978-1-60761-629-0, ПМИД  20301003
  12. ^ Мартин, Карен. «Обзор и применение обратной транскриптазы и кДНК». Золотая биотехнология . Проверено 20 мая 2020 г.
  13. ^ «qPCR, микрочипы или секвенирование РНК - что выбрать?». БиоСистемика . 10 августа 2017 г. Проверено 20 мая 2020 г.
  14. ^ «Синтез кДНК | Bio-Rad». www.bio-rad.com . Проверено 28 мая 2020 г.
  15. ^ Герберт, Закари Т.; Кершнер, Джейми П.; Батти, Винсент Л.; Тиммапурам, Джьоти; Чоудхари, Сулбха; Алексеев Юрий О.; Фан, Джун; Поднар, Джессика В.; Уилкокс, Эдвард; Гипсон, Дженни; Гилласпи, Эллисон (15 марта 2018 г.). «Межсайтовое сравнение наборов для истощения рибосом для создания библиотеки Illumina RNAseq». БМК Геномика . 19 (1): 199. дои : 10.1186/s12864-018-4585-1 . ISSN  1471-2164. ПМК 6389247 . ПМИД  29703133. 
  16. ^ Инвитроген. «Система синтеза кДНК» (PDF) . Термофишер . Архивировано (PDF) из оригинала 22 декабря 2018 года . Проверено 27 мая 2020 г.
  17. ^ Агарвал, Саураб; Макфарлан, Тодд С.; Сартор, Морин А.; Ивасе, Сигеки (21 января 2015 г.). «Секвенирование библиотеки кДНК первой цепи выявляет полноразмерные транскриптомы». Природные коммуникации . 6 (1): 6002. Бибкод : 2015NatCo...6.6002A. doi : 10.1038/ncomms7002. ISSN  2041-1723. ПМК 5054741 . ПМИД  25607527. 
  18. ^ Дериси, Дж.; Пенленд, Л.; Браун, ПО; Биттнер, МЛ; Мельцер, П.С.; Рэй, М.; Чен, Ю.; Су, Я; Трент, Дж. М. (декабрь 1996 г.). «Использование микрочипа кДНК для анализа закономерностей экспрессии генов при раке человека». Природная генетика . 14 (4): 457–460. дои : 10.1038/ng1296-457. ISSN  1546-1718. PMID  8944026. S2CID  23091561.
  19. ^ Уайт, Адам К.; ВанИнсберг, Майкл; Петрив Олег Игоревич; Хамиди, Мани; Сикорский, Дарек; Марра, Марко А.; Пирет, Джеймс; Апарисио, Самуэль; Хансен, Карл Л. (23 августа 2011 г.). «Высокопроизводительная микрофлюидная одноклеточная RT-qPCR». Труды Национальной академии наук . 108 (34): 13999–14004. Бибкод : 2011PNAS..10813999W. дои : 10.1073/pnas.1019446108 . ISSN  0027-8424. ПМК 3161570 . ПМИД  21808033. 
  20. ^ Хрдличкова, Радмила; Толуэ, Масуд; Тиан, Бин (январь 2017 г.). «Методы RNA-Seq для анализа транскриптома». Междисциплинарные обзоры Wiley. РНК . 8 (1): e1364. дои : 10.1002/wrna.1364. ISSN  1757-7004. ПМЦ 5717752 . ПМИД  27198714. 
  21. ↑ Липтак, Адам (13 июня 2013 г.). «Верховный суд постановил, что гены человека не могут быть запатентованы». Нью-Йорк Таймс . Архивировано из оригинала 1 января 2022 года . Проверено 14 июня 2013 г.
  22. ^ Альтфельд, Маркус; Гейл, Майкл младший (1 июня 2015 г.). «Врожденный иммунитет против инфекции ВИЧ-1». Природная иммунология . 16 (6): 554–562. дои : 10.1038/ni.3157 . ISSN  1529-2908. PMID  25988887. S2CID  1577651.
  23. ^ Хавекер, Эрика Р.; Гао, Сян; Войтас, Дэниел Ф. (18 мая 2004 г.). «Разнообразие ретротранспозонов LTR». Геномная биология . 5 (6): 225. doi : 10.1186/gb-2004-5-6-225 . ISSN  1474-760X. ПМК 463057 . ПМИД  15186483. 
  24. ^ Кордо, Ричард; Батцер, Марк А. (октябрь 2009 г.). «Влияние ретротранспозонов на эволюцию генома человека». Обзоры природы Генетика . 10 (10): 691–703. дои : 10.1038/nrg2640. ISSN  1471-0064. ПМК 2884099 . ПМИД  19763152. 

Внешние ссылки