Многоугловое рассеяние света

Рассеивание света под несколькими углами ( MALS ) описывает метод измерения света , рассеянного образцом под несколькими углами. Он используется для определения как абсолютной молярной массы , так и среднего размера молекул в растворе путем обнаружения того, как они рассеивают свет . Чаще всего используется коллимированный луч от лазерного источника, в этом случае метод можно назвать рассеянием света под несколькими углами ( MALLS ). Вставка слова «лазер» была призвана заверить тех, кто привык проводить измерения рассеяния света с помощью обычных источников света, таких как ртутные дуговые лампы , что теперь можно проводить измерения под малыми углами. ^{[ необходима цитата ]}

До появления лазеров и связанных с ними тонких пучков узкой ширины ширина обычных световых пучков, используемых для таких измерений, не позволяла собирать данные при меньших углах рассеяния. В последние годы, поскольку все коммерческие приборы для измерения рассеяния света используют лазерные источники, необходимость упоминать источник света отпала, и термин MALS используется повсеместно.

Термин «многоугольный» относится к обнаружению рассеянного света под разными дискретными углами, например, с помощью одного детектора, перемещаемого в диапазоне, включающем выбранные углы, или массива детекторов, зафиксированных в определенных угловых положениях. Представлено обсуждение физического явления, связанного с этим статическим рассеянием света , включая некоторые приложения, методы анализа данных и графические представления, связанные с ними.

Фон

Измерение рассеянного света от освещенного образца составляет основу так называемого классического измерения рассеяния света . Исторически такие измерения проводились с использованием одного детектора ^{[1] [2],} вращающегося по дуге вокруг освещенного образца. Первым коммерческим прибором (официально называемым «фотометром рассеяния») был фотометр рассеяния света Brice-Phoenix, представленный в середине 1950-х годов, а затем фотометр Sofica, представленный в конце 1960-х годов.

Измерения обычно выражались как интенсивности рассеянного света или рассеянная облученность. Поскольку сбор данных производился, когда детектор размещался в разных местах на дуге, каждое положение соответствовало разным углам рассеяния, концепция размещения отдельного детектора в каждом интересующем угловом месте ^[3] была хорошо понята, хотя и не была реализована в коммерческих целях ^[4] до конца 1970-х годов. Несколько детекторов с разной квантовой эффективностью имеют разный отклик и, следовательно, должны быть нормализованы в этой схеме. Интересная система, основанная на использовании высокоскоростной пленки, была разработана Бранстингом и Маллани ^[5] в 1974 году. Она позволяла регистрировать весь диапазон интенсивностей рассеянного света на пленке с последующим сканированием денситометром , обеспечивающим относительные интенсивности рассеянного света. Тогдашнее общепринятое использование одного детектора, вращающегося вокруг освещенного образца с интенсивностями, собранными под определенными углами, называлось дифференциальным рассеянием света ^[6] по квантово-механическому термину дифференциальное сечение , ^[7] σ(θ), выраженному в миллибарнах/стерадиан. Измерения дифференциального сечения обычно проводились, например, для изучения структуры атомного ядра путем рассеивания им нуклонов, ^[8] таких как нейтроны . Важно различать дифференциальное рассеяние света и динамическое рассеяние света , оба из которых обозначаются аббревиатурой DLS. Последнее относится к совершенно иной методике, измеряющей флуктуацию рассеянного света из-за конструктивной и деструктивной интерференции, причем частота связана с тепловым движением, броуновским движением молекул или частиц в растворе или суспензии.

Для измерения MALS требуется набор вспомогательных элементов. Наиболее важным из них является коллимированный или сфокусированный световой луч (обычно от лазерного источника, создающего коллимированный луч монохроматического света), который освещает область образца. В современных приборах луч обычно плоскополяризован перпендикулярно плоскости измерения, хотя могут использоваться и другие поляризации, особенно при изучении анизотропных частиц. Более ранние измерения, до появления лазеров, проводились с использованием сфокусированных, хотя и неполяризованных, световых лучей от таких источников, как ртутные дуговые лампы. ^{[ необходима цитата ]} Другим необходимым элементом является оптическая ячейка для удерживания измеряемого образца. В качестве альтернативы могут использоваться ячейки, включающие средства, позволяющие измерять текущие образцы. Если необходимо измерить свойства рассеивания отдельных частиц, необходимо обеспечить средство для введения таких частиц по одной через световой луч в точке, обычно равноудаленной от окружающих детекторов.

Хотя большинство измерений на основе MALS выполняются в плоскости, содержащей набор детекторов, обычно равноудаленных от расположенного в центре образца, через который проходит освещающий луч, также были разработаны трехмерные версии ^{[9] [10]} , в которых детекторы лежат на поверхности сферы с образцом, контролируемым для прохождения через его центр, где он пересекает путь падающего светового луча, проходящего по диаметру сферы. Первая структура ^[9] используется для измерения аэрозольных частиц, в то время как последняя ^[10] использовалась для исследования морских организмов, таких как фитопланктон .

Традиционное измерение дифференциального рассеяния света было практически идентично используемому в настоящее время методу MALS. Хотя метод MALS обычно собирает мультиплексированные данные последовательно с выходов набора дискретных детекторов, более раннее измерение дифференциального рассеяния света также собирало данные последовательно, когда один детектор перемещался из одного угла сбора в другой. Реализация MALS, конечно, намного быстрее, но те же типы данных собираются и интерпретируются тем же образом. Таким образом, эти два термина относятся к одной и той же концепции. Для измерений дифференциального рассеяния света фотометр рассеяния света имеет один детектор, тогда как фотометр рассеяния света MALS обычно имеет несколько детекторов.

Другой тип устройства MALS был разработан в 1974 году Зальцманном и др. ^[11] на основе детектора светового рисунка, изобретенного Джорджем и др. ^[12] для Litton Systems Inc. в 1971 году. Детектор Литтона был разработан для отбора проб распределения световой энергии в задней фокальной плоскости сферической линзы для отбора проб геометрических соотношений и распределения спектральной плотности объектов, записанных на прозрачных пленках.

Применение детектора Литтона Зальцманом и др. обеспечило измерение при 32 малых углах рассеяния от 0° до 30° и усреднение по широкому диапазону азимутальных углов, поскольку наиболее важными углами являются прямые углы для статического рассеяния света. К 1980 году Бартоли и др. ^[13] разработали новый подход к измерению рассеяния при дискретных углах рассеяния, используя эллиптический отражатель, позволяющий проводить измерения при 30 полярных углах в диапазоне 2,5° ≤ θ ≤ 177,5° с разрешением 2,1°.

Коммерциализация многоугловых систем началась в 1977 году, когда Science Spectrum, Inc. ^[14] запатентовала проточную капиллярную систему для индивидуальной системы биоанализа, разработанной для USFDA . Первый коммерческий прибор MALS, включающий 8 дискретных детекторов, был поставлен SC Johnson and Son компанией Wyatt Technology Company в 1983 году ^[15], за которым в 1984 году последовала продажа первого проточного прибора с 15 детекторами (Dawn-F) ^[16] компании AMOCO. К 1988 году была представлена ​​трехмерная конфигурация ^[9] специально для измерения рассеивающих свойств отдельных аэрозольных частиц. Примерно в то же время было построено подводное устройство для измерения рассеивающих световых свойств отдельного фитопланктона. ^[10] Сигналы собирались оптическими волокнами и передавались на отдельные фотоумножители. Примерно в декабре 2001 года был выпущен в продажу прибор, измеряющий 7 углов рассеяния с использованием детектора CCD (BI-MwA: Brookhaven Instruments Corp, Hotlsville, NY).

Литература, связанная с измерениями, выполненными с помощью фотометров MALS, обширна. ^{[17] [18]} как в отношении измерений партии частиц/молекул, так и измерений после фракционирования хроматографическими методами, такими как эксклюзионная хроматография ^[19] (SEC), обращенно-фазовая хроматография ^[20] (RPC) и фракционирование в полевом потоке ^[21] (FFF).

Теория

Интерпретация измерений рассеяния, выполненных в многоугольных местах, опирается на некоторые знания априорных свойств измеряемых частиц или молекул. Характеристики рассеяния различных классов таких рассеивателей могут быть наилучшим образом интерпретированы путем применения соответствующей теории. Например, наиболее часто применяются следующие теории.

Рассеяние Рэлея является самым простым и описывает упругое рассеяние света или другого электромагнитного излучения объектами, значительно меньшими, чем длина волны падающего света. Этот тип рассеяния отвечает за голубой цвет неба в течение дня и обратно пропорционален четвертой степени длины волны.

Приближение Рэлея –Ганса является средством интерпретации измерений MALS с предположением, что рассеивающие частицы имеют показатель преломления n ₁ , очень близкий к показателю преломления окружающей среды n ₀ . Если мы положим m = n ₁ /n ₀ и предположим, что |m - 1| << 1 , то такие частицы можно рассматривать как состоящие из очень малых элементов, каждый из которых может быть представлен как рассеивающая Рэлея частица. Таким образом, предполагается, что каждый малый элемент более крупной частицы рассеивается независимо от любого другого.

Теория Лоренца–Ми ^[22] используется для интерпретации рассеяния света однородными сферическими частицами. Приближение Рэлея–Ганса и теория Лоренца–Ми дают идентичные результаты для однородных сфер в пределе |1 − m | → 0 .

Теория Лоренца-Ми может быть обобщена на сферически симметричные частицы по ссылке. ^[23] Более общие формы и структуры были рассмотрены Эрмой. ^[24]

Данные о рассеянии обычно представляются в терминах так называемого избыточного отношения Рэлея, определяемого как отношение Рэлея раствора или отдельного события частицы, из которого вычитается отношение Рэлея самой несущей жидкости и других фоновых вкладов, если таковые имеются. Отношение Рэлея, измеренное на детекторе, лежащем под углом θ и стягивающем телесный угол ΔΩ, определяется как интенсивность света на единицу телесного угла на единицу падающей интенсивности, I ₀ , на единицу освещенного рассеивающего объема ΔV . Рассеивающий объем ΔV , из которого рассеянный свет достигает детектора, определяется полем зрения детектора, обычно ограниченным апертурами, линзами и диафрагмами. Рассмотрим теперь измерение MALS, выполненное в плоскости из суспензии N идентичных частиц/молекул на мл, освещенной тонким пучком света, создаваемым лазером. Предполагая, что свет поляризован перпендикулярно плоскости детекторов. Интенсивность рассеянного света, измеренная детектором под углом θ, превышающая интенсивность, рассеянную суспендирующей жидкостью, будет равна

${\displaystyle I(\theta )={\frac {I_{0}N\Delta V}{(kr)^{2}}}i(\theta )}$,

где i(θ) — функция рассеяния ^[1] отдельной частицы, k = 2πn ₀ /λ ₀ , n ₀ — показатель преломления взвешенной жидкости, а λ ₀ — длина волны падающего света в вакууме. Избыточное отношение Рэлея, R(θ) , тогда определяется как

${\displaystyle R(\theta )={\frac {I(\theta )r^{2}}{I_{0}\Delta V}}=Ni(\theta )/k^{2}}$.

Даже для простой однородной сферы радиусом a, показатель преломления которой n почти равен показателю преломления "n ₀ " взвешенной жидкости, т.е. приближению Рэлея–Ганса, функция рассеяния в плоскости рассеяния является относительно сложной величиной

${\displaystyle i(\theta )={\frac {k^{2}V^{2}\left|{m-1}\right|^{2}}{4\pi ^{2}}}G^{2}\left({2ka\sin {\frac {\theta }{2}}}\right)}$, где

${\displaystyle G(\xi )={\frac {3}{\xi ^{2}}}(\sin \xi -\xi \cos \xi )}$,    ,     ${\displaystyle k={\frac {2\pi n_{0}}{\lambda _{0}}}}$ ${\displaystyle V={\frac {4}{3}}\pi a^{3}}$

а λ ₀ — длина волны падающего света в вакууме.

Приложения

Участок Зимма и сбор партии

участок Зимма

MALS чаще всего используется для характеристики массы и размера молекул в растворе. Ранние реализации MALS, такие как те, которые обсуждались Бруно Х. Зиммом в его статье «Устройства и методы для измерения и интерпретации углового изменения рассеяния света; предварительные результаты по растворам полистирола» ^[1], включали использование одного детектора, вращающегося вокруг образца, содержащегося в прозрачном сосуде. Измерения MALS из нетекучих образцов, таких как этот, обычно называются «партионными измерениями». Создавая образцы с несколькими известными низкими концентрациями и детектируя рассеянный свет вокруг образца под разными углами, можно создать график Зимма ^[25], построив график: vs где c — концентрация образца, а k — коэффициент растяжения, используемый для помещения kc и в один и тот же числовой диапазон. ${\displaystyle {\frac {K^{*}c}{R_{\theta }}}}$ ${\displaystyle \sin ^{2}{\frac {\theta }{2}}+kc}$ ${\displaystyle \sin ^{2}{\frac {\theta }{2}}}$

При построении графика можно экстраполировать как к нулевому углу, так и к нулевой концентрации, а анализ графика даст средний квадратный радиус молекул образца из начального наклона линии c=0 и молярную массу молекулы в точке, где и концентрация, и угол равны нулю. Улучшения графика Зимма, которые включают все собранные данные (обычно называемые «глобальной подгонкой»), в значительной степени заменили график Зимма в современных пакетных анализах. ^[26]

SEC и режим потока

Сигналы MALS для полистирольных сфер

С появлением эксклюзионной хроматографии (SEC) измерения MALS стали использоваться в сочетании с детектором концентрации в режиме реального времени для определения абсолютной молярной массы и размера фракций образца, элюирующих из колонки, а не в зависимости от методов калибровки. Эти измерения MALS в режиме потока были распространены на другие методы разделения, такие как фракционирование потока поля , ионообменная хроматография и обращенно-фазовая хроматография .

Угловая зависимость данных светорассеяния показана ниже на рисунке смеси полистирольных сфер, разделенных с помощью SEC. Два самых маленьких образца (самые правые) элюируются последними и не показывают угловой зависимости. Образец, второй справа, показывает линейное угловое изменение с интенсивностью, увеличивающейся при меньших углах рассеяния. Самый большой образец слева элюируется первым и показывает нелинейное угловое изменение.

Полезность измерений MALS

Молярная масса и размер

Разделение BSA и распределение MM

Сочетание MALS с линейным детектором концентрации после разделения образцов, например SEC, позволяет рассчитать молярную массу элюируемого образца в дополнение к его среднеквадратичному радиусу. На рисунке ниже представлено хроматографическое разделение агрегатов BSA. Показаны сигнал светорассеяния 90° от детектора MALS и значения молярной массы для каждого слоя элюирования.

Молекулярные взаимодействия

Поскольку MALS может предоставить молярную массу и размер молекул, он позволяет изучать белок-белковое связывание, олигомеризацию и кинетику самосборки, ассоциации и диссоциации. Сравнивая молярную массу образца с его концентрацией, можно определить сродство связывания и стехиометрию взаимодействующих молекул.

Разветвление и молекулярная конформация

Коэффициент разветвленности полимера связан с числом единиц разветвления в случайно разветвленном полимере и числом ветвей в звездообразно разветвленных полимерах и был определен Зиммом и Штокмайером как

${\displaystyle g={\frac {R_{b}^{2}}{R_{l}^{2}}}}$

Где - средний квадратный радиус разветвленных и линейных макромолекул с одинаковой молярной массой. ^[27] Используя MALS в сочетании с детектором концентрации, как описано выше, можно создать логарифмический график зависимости среднеквадратичного радиуса от молярной массы. Наклон этого графика дает коэффициент разветвления, g. ^[28] ${\displaystyle R^{2}}$

В дополнение к разветвлению, график размера против молярной массы в двойном логарифмическом масштабе указывает на форму или конформацию макромолекулы. Увеличение наклона графика указывает на изменение конформации полимера от сферической до случайной клубковой и линейной. Объединение среднеквадратичного радиуса из MALS с гидродинамическим радиусом, полученным из измерений DLS, дает коэффициент формы ρ = для каждой фракции размера макромолекулы. ${\displaystyle r_{h}}$ ${\displaystyle {\frac {r_{g}}{r_{h}}}}$

Другие приложения

Другие приложения MALS включают определение размеров наночастиц , ^{[29] [30] [31]} исследования агрегации белков , белок-белковые взаимодействия , электрофоретическую подвижность или дзета-потенциал. Методы MALS были приняты для изучения стабильности фармацевтических препаратов и использования в наномедицине .

Ссылки

1. BA Zimm (1948). «Приборы и методы для измерения и интерпретации угловых изменений рассеяния света; предварительные результаты по растворам полистирола». J. Chem. Phys . 16 (12): 1099–1116. Bibcode :1948JChPh..16.1099Z. doi :10.1063/1.1746740.
2. BA Brice; M. Halwer & R. Speiser (1950). "Фотоэлектрический фотометр рассеяния света для определения высоких молекулярных масс". J. Opt. Soc. Am . 40 (11): 768–778. Bibcode : 1950JOSA...40..768B. doi : 10.1364/JOSA.40.000768.
3. PJ Wyatt в патенте США 3,624,835 (1971), поданном в 1968 году.
4. GC Salzmann; JM Crowell; CA Goad; KM Hansen; и др. (1975). «Прибор для многоуглового рассеяния света в проточной системе для характеристики клеток». Клиническая химия . 21 (9): 1297–1304. doi : 10.1093/clinchem/21.9.1297 . PMID  1149235.
5. A. Brunsting & PF Mullaney (1974). "Дифференциальное рассеяние света сферическими клетками млекопитающих". Biophys. J . 14 (6): 439–453. Bibcode :1974BpJ....14..439B. doi :10.1016/S0006-3495(74)85925-4. PMC 1334522 . PMID  4134589. 
6. PJ Wyatt (1968). «Дифференциальное рассеяние света: физический метод идентификации живых бактериальных клеток». Прикладная оптика . 7 (10): 1879–1896. Bibcode : 1968ApOpt...7.1879W. doi : 10.1364/AO.7.001879. PMID  20068905.
7. См. LI Schiff, Quantum Mechanics (McGraw-Hill Book Company, Нью-Йорк, 1955).
8. S. Fernbach (1958). "Ядерные радиусы, определяемые рассеянием нейтронов". Rev. Mod. Phys . 30 (2): 414–418. Bibcode : 1958RvMP...30..414F. doi : 10.1103/RevModPhys.30.414.
9. PJ Wyatt; YJ Chang; C. Jackson; RG Parker; et al. (1988). «Анализатор аэрозольных частиц». Applied Optics . 27 (2): 217–221. Bibcode :1988ApOpt..27..217W. doi :10.1364/AO.27.000217. PMID  20523583.
10. PJ Wyatt & C. Jackson (1989). "Распознавание фитопланктона по свойствам рассеяния света". Лимнология и океанография . 34 (I): 96–112. Bibcode :1989LimOc..34...96W. doi : 10.4319/lo.1989.34.1.0096 .
11. GC Salzmann; JM Crowell; CA Goad; KM Hansen; и др. (1975). «Прибор для многоуглового рассеяния света в проточной системе для характеристики клеток». Клиническая химия . 21 (9): 1297–1304. doi : 10.1093/clinchem/21.9.1297 . PMID  1149235.>
12. Н. Джордж, А. Шпиндель, Дж. Т. Томассон в патенте США 3689772A (1972), поданном в 1971 году.
13. M. Bartholdi; GC Salzman; RD Hiebert & M. Kerker (1980). "Дифференциальный фотометр рассеяния света для быстрого анализа отдельных частиц в потоке". Applied Optics . 19 (10): 1573–1581. Bibcode : 1980ApOpt..19.1573B. doi : 10.1364/AO.19.001573. PMID  20221079.
14. LV Maldarelli, DT Phillips, WL Proctor, PJ Wyatt и TC Urquhart, Программируемая система отбора проб, патент США 4,140,018 (1979), подан в 1977 году.
15. "Эволюция Wyatt Technology Corp". www.americanlaboratory.com . Получено 2017-02-23 .
16. "музей | о". www.wyatt.com . Получено 2017-02-23 .
17. См., например, Chemical Abstracts
18. "Библиография MALS". www.wyatt.com . Получено 23.02.2017 .
19. AM Striegel; WW Yau; JJ Kirkland & DD Bly (2009). Современная гель-проникающая жидкостная хроматография: практика гель-проникающей и гель-фильтрационной хроматографии. John Wiley and Sons. ISBN 978-0-471-20172-4.
20. IV Astafieva; GA Eberlein; YJ Wang (1996). "Абсолютный онлайновый анализ молекулярной массы основного фактора роста фибробластов и его мультимеров методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии с многоугловым детектированием рассеяния лазерного света" . Журнал хроматографии A. 740 ( 2): 215–229. doi :10.1016/0021-9673(96)00134-3. PMID  8765649.
21. M. Schimpf; K. Caldwell; JC Giddings, ред. (2000). Field-Flow Fractionation Handbook. Wiley-IEEE. ISBN 978-0-471-18430-0.
22. Л. В. Лоренц (1890). «Распространение света внутри и снаружи сферы, освещенной плоскими световыми волнами». Videnski.Selsk.Skrifter . 6 : 1–62.
23. PJ Wyatt (1962). «Рассеяние электромагнитных плоских волн от неоднородных сферически симметричных объектов». Physical Review . 127 (5): 1837–1843. Bibcode : 1962PhRv..127.1837W. doi : 10.1103/PhysRev.127.1837.Балаж, Луис (1964). "Errata Ibid". Physical Review . 134 (7AB): AB1. Bibcode : 1964PhRv..134....1B. doi : 10.1103/physrev.134.ab1.2 .
24. VA Erma (1968a). «Точное решение для рассеяния электромагнитных волн от проводников произвольной формы: I. Случай цилиндрической симметрии». Physical Review . 173 (5): 1243–1257. Bibcode :1968PhRv..173.1243E. doi :10.1103/physrev.173.1243.VA Erma (1968b). "Точное решение для рассеяния электромагнитных волн от проводников произвольной формы: II. Общий случай". Physical Review . 176 (5): 1544–1553. Bibcode :1968PhRv..176.1544E. doi :10.1103/physrev.176.1544.VA Erma (1969). «Точное решение для рассеяния электромагнитных волн от тел произвольной формы: III. Препятствия с произвольными электромагнитными свойствами». Physical Review . 179 (5): 1238–1246. Bibcode :1969PhRv..179.1238E. doi :10.1103/physrev.179.1238.
25. Wyatt, PJ (1993). «Рассеяние света и абсолютная характеристика макромолекул». Analytica Chimica Acta . 272 : 1–40. doi :10.1016/0003-2670(93)80373-S.
26. Trainoff, SP (18 ноября 2003 г.). "Патент США № 6,651,009 B1". Патентное ведомство США .
27. Зимм, Бруно Х. (1949). «Размеры цепных молекул, содержащих разветвления и кольца». J. Chem. Phys . 17 (12): 1301. Bibcode :1949JChPh..17.1301Z. doi :10.1063/1.1747157.
28. Podzimek, Stepan (1994). «Использование ГПХ в сочетании с многоугловым лазерным светорассеивающим фотометром для характеристики полимеров. Об определении молекулярной массы, размера и разветвленности». Журнал прикладной полимерной науки . 54 : 91–103. doi :10.1002/app.1994.070540110.
29. Waghwani HK, Douglas, T (март 2021 г.). «Цитохром C с пероксидазоподобной активностью, инкапсулированный внутри небольшой наноклетки белка DPS». Journal of Materials Chemistry B. 9 ( 14): 3168–3179. doi :10.1039/d1tb00234a. PMID  33885621.
30. Waghwani HK, Uchida M, Douglas, T (апрель 2020 г.). «Вирусоподобные частицы (VLP) как платформа для иерархической компартментализации». Biomacromolecules . 21 (6): 2060–2072. doi : 10.1021/acs.biomac.0c00030 . PMID  32319761.
31. Wang Y, Uchida M, Waghwani HK, Douglas, T (декабрь 2020 г.). «Синтетические вирусоподобные частицы для биосинтеза глутатиона». ACS Synthetic Biology . 9 (12): 3298–3310. doi :10.1021/acssynbio.0c00368. PMID  33232156. S2CID  227167991.