Нокаут-мышь

Генетически модифицированная мышь, используемая в генных исследованиях

Нокаутная мышь , или нокаутная мышь , — это генетически модифицированная мышь ( Mus musculus ), в которой исследователи инактивировали или « выключили » существующий ген , заменив его или нарушив его искусственным фрагментом ДНК . Они являются важными животными-моделями для изучения роли генов, которые были секвенированы , но чьи функции не были определены. Заставив определенный ген быть неактивным у мыши и наблюдая любые отличия от нормального поведения или физиологии, исследователи могут сделать вывод о его вероятной функции.

В настоящее время мыши являются лабораторными животными, наиболее тесно связанными с людьми , для которых можно легко применить технику нокаута. Они широко используются в экспериментах по нокауту, особенно в тех, которые исследуют генетические вопросы, связанные с физиологией человека . Нокаут генов у крыс гораздо сложнее и стал возможен только с 2003 года. ^{[1] [2]}

Первая зарегистрированная мышь с нокаутом была создана Марио Р. Капеччи , Мартином Эвансом и Оливером Смитисом в 1989 году, за что они были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине 2007 года . Аспекты технологии создания мышей с нокаутом и сами мыши были запатентованы во многих странах частными компаниями.

Использовать

Лабораторная мышь, у которой был отключен ген, отвечающий за рост волос (слева), показана рядом с нормальной лабораторной мышью.

Выключение активности гена дает информацию о том, что этот ген обычно делает. У людей и мышей много общих генов. Следовательно, наблюдение за характеристиками выключённых мышей даёт исследователям информацию, которую можно использовать для лучшего понимания того, как похожий ген может вызывать или способствовать возникновению заболеваний у людей.

Примерами исследований, в которых нокаутные мыши были полезны, являются изучение и моделирование различных видов рака , ожирения , заболеваний сердца , диабета , артрита , злоупотребления психоактивными веществами , тревожности , старения и болезни Паркинсона . Нокаутные мыши также предлагают биологический и научный контекст, в котором могут быть разработаны и испытаны лекарства и другие методы лечения.

Миллионы мышей с нокаутированным геном используются в экспериментах каждый год. ^[3]

Штаммы

Нокаутированная мышь (слева), которая является моделью ожирения, по сравнению с нормальной мышью

Существует несколько тысяч различных штаммов нокаутных мышей. ^[3] Многие мышиные модели названы в честь гена, который был инактивирован. Например, мышь с нокаутным геном p53 названа в честь гена p53, который кодирует белок, который обычно подавляет рост опухолей, останавливая деление клеток и/или вызывая апоптоз. Люди, рожденные с мутациями, которые деактивируют ген p53, имеют синдром Ли-Фраумени , состояние, которое резко увеличивает риск развития рака костей, рака молочной железы и рака крови в раннем возрасте. Другие мышиные модели названы в соответствии с их физическими характеристиками или поведением.

Процедура

Процедура создания бластоцисты смешанного генотипа

Схема разведения для получения нокаутированных мышей. Бластоцисты, содержащие клетки, которые являются как дикими, так и нокаутированными клетками, вводятся в матку приемной матери. Это дает потомство, которое либо является диким типом и окрашено в тот же цвет, что и донор бластоцисты (серый), либо химерное (смешанное) и частично нокаутировано. Химерных мышей скрещивают с нормальной мышью дикого типа (серой). Это дает потомство, которое либо белое и гетерозиготное по нокаутированному гену, либо серое и дикого типа. Белых гетерозиготных мышей можно впоследствии скрещивать для получения мышей, которые являются гомозиготными по нокаутированному гену.

Существует несколько вариантов процедуры получения нокаутированных мышей; ниже приведен типичный пример.

1. Ген, который нужно вырубить, выделяется из библиотеки генов мыши . Затем конструируется новая последовательность ДНК , которая очень похожа на исходный ген и его непосредственную соседнюю последовательность, за исключением того, что она достаточно изменена, чтобы сделать ген неработоспособным. Обычно новой последовательности также присваивается ген- маркер , ген, которого нет у нормальных мышей и который придает устойчивость к определенному токсичному агенту (например, неомицину) или который производит наблюдаемое изменение (например, цвет или флуоресценцию). Кроме того, в конструкцию также включается второй ген, такой как герпес tk+, чтобы осуществить полный отбор.
2. Эмбриональные стволовые клетки выделяются из бластоцисты мыши (очень молодой эмбрион ) и выращиваются in vitro . Для этого примера мы возьмем стволовые клетки белой мыши.
3. Новая последовательность из шага 1 вводится в стволовые клетки из шага 2 посредством электропорации . В результате естественного процесса гомологичной рекомбинации некоторые из электропорированных стволовых клеток включат новую последовательность с выбитым геном в свои хромосомы вместо исходного гена. Шансы на успешное событие рекомбинации относительно низки, поэтому большинство измененных клеток будут иметь новую последовательность только в одной из двух соответствующих хромосом — их называют гетерозиготными . Клетки, трансформированные вектором, содержащим ген устойчивости к неомицину и ген герпеса tk+, выращивают в растворе, содержащем неомицин и ганцикловир, чтобы отобрать трансформации, произошедшие посредством гомологичной рекомбинации. Любая вставка ДНК, произошедшая посредством случайной вставки, погибнет, поскольку они дадут положительный результат как на ген устойчивости к неомицину, так и на ген герпеса tk+, чей генный продукт реагирует с ганцикловиром, производя смертельный токсин. Более того, клетки, в которых не интегрируется ни один генетический материал, дают отрицательный результат на оба гена и поэтому погибают в результате отравления неомицином.
4. Эмбриональные стволовые клетки, в которых включен отключенный ген, изолируются от неизмененных клеток с помощью маркерного гена из шага 1. Например, неизмененные клетки можно убить с помощью токсичного агента, к которому измененные клетки устойчивы.
5. Нокаутированные эмбриональные стволовые клетки из шага 4 вставляются в бластоцисту мыши. Для этого примера мы используем бластоцисты от серой мыши. Теперь бластоцисты содержат два типа стволовых клеток: исходные (от серой мыши) и нокаутированные клетки (от белой мыши). Затем эти бластоцисты имплантируются в матку самок мышей, где они развиваются. Таким образом, новорожденные мыши будут химерами : некоторые части их тел являются результатом исходных стволовых клеток, другие части — нокаутированных стволовых клеток. Их мех будет иметь пятна белого и серого цвета, с белыми пятнами, полученными от нокаутированных стволовых клеток, и серыми пятнами от бластоцисты-реципиента.
6. У некоторых новорожденных химерных мышей будут гонады, полученные из нокаутированных стволовых клеток, и поэтому они будут производить яйцеклетки или сперму, содержащие нокаутированный ген. Когда эти химерные мыши скрещиваются с другими дикими мышами, некоторые из их потомков будут иметь одну копию нокаутированного гена во всех своих клетках. Эти мыши не сохраняют никакой ДНК серой мыши и не являются химерами, однако они все еще гетерозиготны.
7. При скрещивании этих гетерозиготных потомков некоторые из них унаследуют отключенный ген от обоих родителей; они не несут функциональной копии исходного неизмененного гена (т. е. они гомозиготны по этому аллелю).

Подробное объяснение того, как создаются мыши с нокаутом (KO), можно найти на веб-сайте Нобелевской премии по физиологии и медицине 2007 года. ^[4]

Ограничения

Национальные институты здравоохранения обсуждают некоторые важные ограничения этого метода. ^[5]

Хотя технология нокаутных мышей представляет собой ценный исследовательский инструмент, существуют некоторые важные ограничения. Около 15 процентов нокаутов генов являются летальными для развития, что означает, что генетически измененные эмбрионы не могут вырасти во взрослых мышей. Эта проблема часто преодолевается с помощью использования условных мутаций . Отсутствие взрослых мышей ограничивает исследования эмбриональным развитием и часто затрудняет определение функции гена по отношению к здоровью человека . В некоторых случаях ген может выполнять другую функцию у взрослых, чем у развивающихся эмбрионов.

Выключение гена также может не привести к наблюдаемым изменениям у мыши или даже может привести к другим характеристикам, чем те, которые наблюдаются у людей, у которых тот же ген инактивирован. Например, мутации в гене p53 связаны с более чем половиной случаев рака у человека и часто приводят к опухолям в определенном наборе тканей. Однако, когда ген p53 выключается у мышей, у животных развиваются опухоли в другом наборе тканей.

Существует вариабельность во всей процедуре, в значительной степени зависящая от штамма, из которого были получены стволовые клетки. Обычно используются клетки, полученные из штамма 129. Этот конкретный штамм не подходит для многих экспериментов (например, поведенческих), поэтому очень часто приходится скрещивать потомство с другими штаммами. Было доказано, что некоторые геномные локусы очень трудно выключить. Причинами могут быть наличие повторяющихся последовательностей, обширное метилирование ДНК или гетерохроматин . Смешивающее присутствие соседних генов 129 на выключаемом сегменте генетического материала было названо «эффектом фланкирующего гена». ^[6] Были предложены методы и рекомендации по решению этой проблемы. ^{[7] [8]}

Другим ограничением является то, что обычные (т. е. неусловные) нокаутные мыши развиваются в отсутствие исследуемого гена. Иногда потеря активности во время развития может маскировать роль гена во взрослом состоянии, особенно если ген участвует в многочисленных процессах, охватывающих развитие. Тогда требуются подходы с условными/индуцируемыми мутациями, которые сначала позволяют мыши нормально развиваться и созревать перед удалением интересующего гена.

Другим серьезным ограничением является отсутствие эволюционных адаптаций в модели нокаута, которые могут возникнуть у животных дикого типа после их естественной мутации. Например, специфическая для эритроцитов коэкспрессия GLUT1 со стоматином представляет собой компенсаторный механизм у млекопитающих , которые не способны синтезировать витамин C. ^[9]

Смотрите также

• Химера (генетика)
• Генетически модифицированный организм
• Генетика
• Гумус
• Международный консорциум мышей с нокаутом
• Международный консорциум по фенотипированию мышей
• Нокаутирующий мох
• Онкомышь

Ссылки

1. Pilcher HR (2003-05-19). "Это нокаут". Nature . doi :10.1038/news030512-17 . Получено 2014-04-03 .
2. Zan Y, Haag JD, Chen KS, Shepel LA, Wigington D, Wang YR, Hu R, Lopez-Guajardo CC, Brose HL, Porter KI, Leonard RA, Hitt AA, Schommer SL, Elegbede AF, Gould MN (июнь 2003 г.). «Производство нокаутированных крыс с использованием мутагенеза ENU и скринингового анализа на основе дрожжей». Nature Biotechnology . 21 (6): 645–51. doi :10.1038/nbt830. PMID  12754522. S2CID  32611710.
3. Spencer G (декабрь 2002 г.). «История вопроса о мыши как модельном организме». Национальный институт исследований генома человека . Получено 03.04.2014 .
4. "Нобелевская премия по физиологии и медицине 2007 года". Nobelprize.org. 1985-09-19 . Получено 2014-04-03 .
5. "Информационный листок о мышах с нокаутом". Национальный институт исследований генома человека. Август 2015 г. Получено 03.04.2014 г.
6. Gerlai R (май 1996). «Исследования поведения млекопитающих с помощью генов: мутация или фоновый генотип?». Trends in Neurosciences . 19 (5): 177–81. doi :10.1016/S0166-2236(96)20020-7. PMID  8723200. S2CID  33396039.
7. Wolfer DP, Crusio WE , Lipp HP (июль 2002 г.). «Нокаутные мыши: простые решения проблем генетического фона и фланговых генов». Trends in Neurosciences . 25 (7): 336–40. doi :10.1016/S0166-2236(02)02192-6. PMID  12079755. S2CID  33777888.
8. Crusio WE, Goldowitz D, Holmes A, Wolfer D (февраль 2009 г.). «Стандарты публикации исследований мутантов на мышах». Genes, Brain and Behavior . 8 (1): 1–4. doi : 10.1111/j.1601-183X.2008.00438.x . PMID  18778401. S2CID  205853147.
9. Montel-Hagen A, Kinet S, Manel N, Mongellaz C, Prohaska R, Battini JL, Delaunay J, Sitbon M, Taylor N (март 2008 г.). «Эритроцитный Glut1 запускает поглощение дегидроаскорбиновой кислоты у млекопитающих, неспособных синтезировать витамин C». Cell . 132 (6): 1039–48. doi : 10.1016/j.cell.2008.01.042 . PMID  18358815.

Внешние ссылки

• Техасский институт геномной медицины A&M (TIGM) – веб-сайт для заказа эмбриональных стволовых клеток и мышей, полученных с помощью TIGM
• Создание нокаутированных мышей для нацеливания вектора из исследований нокаутированных мышей (KMR) – веб-сайт для заказа эмбриональных стволовых клеток, нацеливающих векторов и трансгенных мышей, созданных с помощью KMR.
• Изучение функции гена: создание мышей с нокаутом — обзор из Science Creative Quarterly
• Веб-сайт координации данных проекта Knock Out Mouse Project (KOMP) – общедоступный интерфейс для получения информации о статусе генов, включенных в инициативу KOMP.
• Веб-сайт репозитория проекта Knock Out Mouse Project (KOMP) – Веб-сайт для заказа ES-клеток, векторов и мышей, созданных в рамках проекта KOMP.
• Веб-сайт Mouse Genome Informatics (MGI) – база данных модельных организмов для лабораторных мышей.
• Метод гомологичной рекомбинации (и нокаутированная мышь)
• Информационный листок о мышах с нокаутом (Genome.gov)