Нуклеозиддифосфаткиназы ( NDPK , также NDP-киназа , ( поли ) нуклеотидкиназы и нуклеозиддифосфокиназы ) — это ферменты , которые катализируют обмен терминального фосфата между различными нуклеозиддифосфатами (NDP) и трифосфатами (NTP) обратимым образом с образованием нуклеотидтрифосфатов . Многие NDP служат акцепторами, в то время как NTP являются донорами фосфатной группы. Общая реакция по механизму пинг-понга выглядит следующим образом: XDP + YTP ←→ XTP + YDP (X и Y представляют разные азотистые основания). Активность NDPK поддерживает равновесие между концентрациями различных нуклеозидтрифосфатов, например, когда гуанозинтрифосфат (GTP), образующийся в цикле лимонной кислоты (Кребса), превращается в аденозинтрифосфат (ATP). [1] Другие виды деятельности включают пролиферацию клеток, дифференциацию и развитие, передачу сигнала , рецептор, связанный с G-белком , эндоцитоз и экспрессию генов .
NDPK — это гомогексамерные белки, состоящие из мономеров длиной около 152 аминокислот с теоретической массой 17,17 кДа. [2] Комплекс обнаружен в митохондриях и в растворимой цитоплазме клеток.
NDPK встречаются во всех клетках, не проявляя особой специфичности к типам нуклеозидных оснований и способны принимать нуклеотиды и дезоксирибонуклеотиды в качестве субстратов или доноров. [3] Таким образом, NDPK является источником предшественников РНК и ДНК, за исключением АТФ. [4] NDPK используют специфическую ферментативную кинетику для мультисубстратной реакции, а именно механизм пинг-понга . Механизм пинг-понга объединяет фосфорилирование остатка гистидина путем переноса терминальной фосфатной группы (γ-фосфата) с АТФ на β-фосфат NDP для получения NTP, а NDPK катализирует такие обратимые реакции. [5] NTP фосфорилирует гистидин, который, в свою очередь, фосфорилирует NDP . NDPK участвуют в синтезе нуклеозидтрифосфатов (NTP), таких как гуанозинтрифосфат (GTP), цитидинтрифосфат (CTP) и уридинтрифосфат (UTP), тимидинтрифосфат (TTP). [6]
За этой, казалось бы, простой реакцией скрывается многоступенчатый механизм. Ключевые этапы трансфосфорилирования следующие:
Каждый шаг является частью обратимого процесса, так что многошаговое равновесие имеет следующий вид.
Роли NDPK в этих NTP различаются; как правило, киназы вводят NTP для синтеза нуклеиновых кислот. CTP обеспечивает синтез липидов , UTP — синтез полисахаридов , в то время как GTP используется для удлинения белков и передачи сигнала . [3] Во время опосредованной цАМФ передачи сигнала NDPK отвечает за фосфорилирование GDP, высвобождаемого из G-белков, активированных при связывании с рецептором; как только АТФ отдает фосфатную группу через активность NDPK, GTP последовательно связывается. [7] Повышенная активность мембранно-ассоциированной NDPK приводит к синтезу цАМФ. NDPK контролирует каналы K+, G-белки, клеточную секрецию, выработку клеточной энергии и синтез UTP.
NDPK обычно потребляет АТФ, наиболее распространенный клеточный нуклеотид, и хранит нуклеотиды. Однако потребление АТФ определенно влияет на энергетический баланс клетки, что приводит к регуляции AMP-активируемой протеинкиназы ( AMPK ). [8] AMPK действует как датчик энергии и регулирует пути АТФ, поворачивая генерирующие пути или нет. Из-за такой активности AMPK может напрямую ингибировать NDPK через фосфорилирование . Если быть более конкретным, NDPK поддерживает производство нуклеотидов в высокоэнергетических и низкострессовых клеточных состояниях. Однако это может произойти только тогда, когда AMPK инактивирована, поскольку низкострессовые клеточные состояния АТФ запускают активацию AMPK, что в конечном итоге снижает активность NDPK путем фосфорилирования остатков серина.
У большинства прокариот фермент NDPK является тетрамерным . Он был зарегистрирован у ряда патогенов. Функция NDPK была изучена у Escherichia coli , Bacillus subtilis , Salmonella typhimurium , Micrococcus luteus и Myxococcus xanthus . [9] Прокариотическая NDPK образует функциональный гомотетрамер . Активность нуклеозиддифосфаткиназы включает перенос γ-фосфата нуклеозидтрифосфата (NTP) в нуклеозиддифосфат (NDP), где N1 и N2 могут быть рибо- или дезоксирибонуклеозидами. Это осуществляется через высокоэнергетический промежуточный фосфогистидин. Помимо участия в синтезе пиримидиновых нуклеотидов , прокариотическая NDPK также участвует в нескольких циклах метаболизма. Было также обнаружено, что NDPK действует как протеингистидинкиназа , которая включает обратимое фосфорилирование гистидина как хорошо известный регуляторный сигнал. [10] Однако у большинства прокариот уровни экспрессии NDPK участвуют в росте клеток, развитии и дифференцировке организма, особенно бактерий .
В цикле биосинтеза (p)ppGpp NDPK играет важную роль. Когда в участке A рибосомы отсутствует заряженная тРНК , рибосома останавливается и запускает синтез молекулы пентафосфата гуанозина ((p)ppGpp). Биосинтез (p)ppGpp является частью пути метаболизма пуринов и координирует ряд клеточных активностей в ответ на изобилие питательных веществ. [11] Синтез (p)ppGpp запускается углеродным голоданием или недостатком углерода в среде клетки и вызывает активацию белка SpoT. SpoT работает совместно с NDPK, и оба служат основными ферментами в цикле биосинтеза (p)ppGpp. NDPK синтезирует образование GDP из GTP посредством дефосфорилирования. [12]
Хотя биомолекулярный механизм, с помощью которого ген Nm23 работает в клетках, в настоящее время неизвестен, как и у большинства прокариот, уровни экспрессии нуклеозиддифосфаткиназы (NDPK) определяют рост и дифференциацию клеток. [3] Обычно ген Nm23 (NME) участвует в подавлении метастазирования у людей. У прокариот ген Nm23 участвует в нормальном развитии и дифференциации клеток. Высококонсервативные гомологи гена Nm23 были обнаружены у прокариот, а именно у Myxococcus xanthus , грамотрицательной почвенной бактерии. Гомологи Nm23 у M. xanthus были закрыты и охарактеризованы как нуклеозиддифосфаткиназа (ген ndk) и, по-видимому, необходимы для роста M. xanthus . Во время развития M. xanthus также было показано, что активность нуклеозиддифосфаткиназы резко снижается. [13]
У человека существует по крайней мере четыре ферментативно активных изоформы NDPK: NDPK-A, NDPK-B, NDPK-C и NDPK-D. Все четыре изоформы имеют очень похожие структуры и могут объединяться в любую форму, чтобы стать функциональными гексамерами NDPK. Предполагается, что NDPK участвует в трансмембранной сигнализации в эукариотических клетках. [14]
В эукариотических системах роль NDK заключается в синтезе нуклеозидтрифосфатов, отличных от АТФ. Гамма-фосфат АТФ переносится на бета-фосфат НДП по механизму пинг-понга с использованием фосфорилированного промежуточного продукта активного центра и синтезирует такие продукты, как УТФ. NDK обладает активностью нуклеозиддифосфаткиназы, серин/треонин-специфической протеинкиназы, геранил- и фарнезилпирофосфаткиназы, гистидинпротеинкиназы и 3'-5' экзонуклеазы. Ее процессы связаны с пролиферацией, дифференциацией и развитием клеток, а также экспрессией генов в клетках человека. Она также является частью процесса развития нейронов, который включает нейронное паттернирование и определение судьбы клеток. Кроме того, NDPK участвует в процессах передачи сигнала и эндоцитозе рецептора, связанного с G-белком, поскольку она переносит фосфатную группу на субъединицы G β и преобразует GDP в GTP. Это увеличение концентрации ГТФ вблизи α-субъединиц G-белка вызывает активацию α-субъединиц G-белка для передачи сигналов G-белка. [15] Помимо передачи сигналов, NDPK участвует в контроле каналов K+, клеточной секреции и выработке клеточной энергии.
Биохимические реакции, катализируемые киназой NDP в растениях, аналогичны описанным у людей процессам, поскольку аутофосфорилирование происходит из АТФ и ГТФ. В дополнение к этому, у растений есть четыре типа изоформ NDPK. Цитозольный тип I NDPK участвует в метаболизме, росте и реакциях на стресс у растений. [16] Тип II NDPK сосредоточен в хлоропласте и, как полагают, участвует в процессе фотосинтеза и управлении окислительным стрессом, но его функция пока неясна. [16] Тип III NDPK нацелен как на митохондрии, так и на хлоропласты, и в основном участвует в энергетическом метаболизме. [16] Локализация и точная функция типа IV NDPK пока не очень хорошо известны и требуют дальнейших исследований. [16] Кроме того, NDPK связана с опосредованной H 2 O 2 митоген-активируемой протеинкиназной сигнализацией в растениях. [17]
Десять паралогичных генов кодируют белки NDPK, которые разделены на две группы. Первая группа кодирует белки с функциями NDPK. Гены другой группы кодируют другие различные белки, которые проявляют низкую или нулевую активность NDPK. В первой группе один из генов, названный NM23, был идентифицирован как первый белок-супрессор метастазов, и его ген Nm23 был менее активирован в метастатических клетках. В другом эксперименте человеческий Nm23 культивировали с раковыми клетками и показали ингибирование метастазов. Уровень белка NM23 был обратно пропорционален метастатическому потенциалу для человеческих солидных опухолей. Однако другие типы опухолей, такие как рак яичников, нейробластома и гематологические злокачественные новообразования, показали повышенные уровни NM23 в образцах пациентов. Поэтому понимание биологической основы семейства генов Nm23 необходимо для того, чтобы иметь твердое представление о его разнообразных результатах.
Nme2, один из генов NDPK, был связан с сердечно-сосудистыми функциями. Известно, что ген Nme2 образует комплекс с бета-субъединицей гетеротриметрического G-белка в клетках сердца и регулирует сократимость сердца. Существует две функции Nme2, которые обеспечивают такую регуляцию; одна из них — активность гистидинкиназы, которая представляет собой фосфорилирование каналов для регулирования того, что проходит, а другая — функция каркаса образования кавеол . Истощение взаимодействия Nme2/кавеолина показало снижение скорости сократимости сердца. [18] Более того, дополнительные исследования с рыбой-зеброй показали, что истощение NDPK оказывает пагубное влияние на работу сердца. [19]
Было много споров о том, отвечает ли ген NM23 за подавление или активацию метастазов. Две противоборствующие стороны по этому вопросу оставались неоднозначными и неопределенными на протяжении всего курса исследований NDPK. Однако недавние эксперименты начали показывать доказательства того, что NM23 является супрессором метастазов. Nme2 был помечен как ген антиметастазов с использованием технологии тканевых чипов и иммуногистохимии . Когда продукты гена Nme2 были перепродуцированы в клетках рака желудка, наблюдалось снижение пролиферации, миграции и инвазии таких раковых клеток. Культуры клеток показали, что Nme2 влияет на клетки рака желудка, но все еще остается вопрос о том, что регулирует активность Nme2 среди различных типов рака. [20] Nme1 был обнаружен в большом количестве в слабо метастатических сублиниях клеток меланомы . Кроме того, трансфекция Nme1 в сильно метастатическую линию меланомы значительно снизила метастазы. Эта теория была также проверена на мышах; мыши с дефицитом Nme1 образовывали больше метастазов в легких, чем мыши дикого типа, что показывает, что этот ген обладает подавляющей активностью. Вторжение рака происходит из-за изменений в адгезии клеток и вызвано изменениями экспрессии генов в эпителиально-мезенхимальном переходе (EMT). Удивительно, но существует множество молекул адгезии, факторов подвижности , сигнальных путей, протеолитических событий, признаков EMT и других транскрипционных программ, которые связаны с белками Nme1. Эти белки прерывают метастазирование, связывая белки, способствующие метастазированию. Белки Nme1 связываются с вирусными белками, онкогенами и другими факторами, способствующими метастазированию. Связывание может быть косвенным с использованием сигнального комплекса. [20]
