Нуклеосома — основная структурная единица упаковки ДНК у эукариот . Структура нуклеосомы состоит из участка ДНК, намотанного вокруг восьми белков-гистонов [1] и напоминает нить, намотанную на катушку. Нуклеосома является основной субъединицей хроматина . Каждая нуклеосома состоит из чуть менее двух витков ДНК, обернутых вокруг набора из восьми белков, называемых гистонами, которые известны как гистоновый октамер . Каждый октамер гистонов состоит из двух копий каждого из белков-гистонов H2A , H2B , H3 и H4 .
ДНК должна быть уплотнена в нуклеосомы, чтобы поместиться в ядре клетки . [2] Помимо упаковки нуклеосомы, эукариотический хроматин дополнительно уплотняется за счет сворачивания в ряд более сложных структур, в конечном итоге образующих хромосому . Каждая клетка человека содержит около 30 миллионов нуклеосом. [3]
Считается, что нуклеосомы несут эпигенетически наследуемую информацию в форме ковалентных модификаций своих основных гистонов . Положения нуклеосом в геноме не случайны, и важно знать, где расположена каждая нуклеосома, поскольку это определяет доступность ДНК для регуляторных белков . [4]
Нуклеосомы были впервые обнаружены как частицы в электронном микроскопе Доном и Адой Олинс в 1974 году [5] , а их существование и структура (как октамеры гистонов, окруженные примерно 200 парами оснований ДНК) были предложены Роджером Корнбергом . [6] [7] Роль нуклеосомы как регулятора транскрипции была продемонстрирована Lorch et al. in vitro [8] в 1987 г., а также Ханом и Грунштейном [9] и Кларком-Адамсом и др. [10] in vivo в 1988 г.
Коровая частица нуклеосомы состоит примерно из 146 пар оснований (п.н.) ДНК [11], завернутых в 1,67 левых суперспиральных витков вокруг октамера гистонов , состоящего из 2 копий каждого из коровых гистонов H2A , H2B , H3 и H4 . [12] Частицы ядра соединены участками линкерной ДНК , длина которых может достигать примерно 80 пар оснований. Технически нуклеосома определяется как ядро частицы плюс одна из этих линкерных областей; однако это слово часто является синонимом основной частицы. [13] Полногеномные карты расположения нуклеосом теперь доступны для многих модельных организмов и клеток человека. [14]
Линкерные гистоны, такие как H1 и его изоформы, участвуют в уплотнении хроматина и располагаются у основания нуклеосомы рядом с входом и выходом ДНК, связываясь с линкерной областью ДНК. [15] Неконденсированные нуклеосомы без линкерного гистона напоминают «бусинки на нити ДНК» под электронным микроскопом . [16]
В отличие от большинства эукариотических клеток, зрелые сперматозоиды в основном используют протамины для упаковки своей геномной ДНК, скорее всего, для достижения еще более высокого коэффициента упаковки. [17] Эквиваленты гистонов и упрощенная структура хроматина также были обнаружены у архей , [18] что позволяет предположить, что эукариоты — не единственные организмы, которые используют нуклеосомы.
Новаторские структурные исследования, проведенные в 1980-х годах группой Аарона Клуга, предоставили первые доказательства того, что октамер гистоновых белков обертывает ДНК вокруг себя примерно за 1,7 витка левой суперспирали. [19] В 1997 году группа из Ричмонда впервые расшифровала кристаллическую структуру нуклеосомы с разрешением, близким к атомному, показав наиболее важные детали частицы. Альфа-сателлитная палиндромная ДНК человека, имеющая решающее значение для достижения кристаллической структуры нуклеосомы 1997 года, была разработана группой Буника в Национальной лаборатории Ок-Ридж в Теннесси. [20] [21] [22] [23] [24] На сегодняшний день решены структуры более 20 различных ядерных частиц нуклеосом, [25] включая те, которые содержат варианты гистонов и гистоны разных видов. Структура коровой частицы нуклеосомы удивительно консервативна, и даже замена более 100 остатков между гистонами лягушки и дрожжей приводит к появлению карт электронной плотности с общим среднеквадратичным отклонением всего 1,6 Å. [26]
Коровая частица нуклеосомы (показана на рисунке) состоит примерно из 146 пар оснований ДНК [11], обернутых 1,67 левосторонними суперспиральными витками вокруг октамера гистонов , состоящих из 2 копий каждого из коровых гистонов H2A , H2B , H3 и Н4 . Соседние нуклеосомы соединены участком свободной ДНК, называемым линкерной ДНК (длина которого варьируется от 10 до 80 пар оснований в зависимости от вида и типа ткани [18] ). Вся структура образует цилиндр диаметром 11 нм и высотой 5,5 нм. .
Частицы ядра нуклеосомы наблюдаются, когда хроматин в интерфазе обрабатывается, чтобы заставить хроматин частично развернуться. Полученное изображение, полученное с помощью электронного микроскопа, представляет собой «бусины на нитке». Нить — это ДНК, а каждая бусинка нуклеосомы — это центральная частица. Коровая частица нуклеосомы состоит из ДНК и белков-гистонов. [29]
Частичное расщепление ДНКазой хроматина раскрывает его нуклеосомную структуру. Поскольку участки ДНК ядерных частиц нуклеосом менее доступны для ДНКазы, чем связывающие участки, ДНК расщепляется на фрагменты длиной, равной кратности расстояния между нуклеосомами (180, 360, 540 пар оснований и т. д.). Следовательно, во время гель-электрофореза этой ДНК виден очень характерный рисунок, похожий на лестницу . [27] Такое переваривание может происходить и в естественных условиях во время апоптоза («самоубийство клетки» или запрограммированная смерть клетки), поскольку его ролью обычно является саморазрушение ДНК . [ нужна цитата ]
Коровые гистоновые белки содержат характерный структурный мотив, называемый «складкой гистонов», который состоит из трех альфа-спиралей (α1-3), разделенных двумя петлями (L1-2). В растворе гистоны образуют гетеродимеры H2A-H2B и гетеротетрамеры H3-H4. Гистоны димеризуются вокруг своих длинных α2-спиралей в антипараллельной ориентации, а в случае H3 и H4 два таких димера образуют пучок из 4 спиралей, стабилизированный обширным взаимодействием H3-H3'. Димер H2A/H2B связывается с тетрамером H3/H4 за счет взаимодействий между H4 и H2B, которые включают образование гидрофобного кластера. [12] Октамер гистонов образован центральным тетрамером H3/H4, зажатым между двумя димерами H2A/H2B. Из-за сильно основного заряда всех четырех основных гистонов октамер гистонов стабилен только в присутствии ДНК или очень высоких концентраций соли.
Нуклеосома содержит более 120 прямых взаимодействий белок-ДНК и несколько сотен водоопосредованных. [30] Прямые взаимодействия белок-ДНК не распределены равномерно по поверхности октамера, а расположены в дискретных участках. Это связано с образованием двух типов сайтов связывания ДНК внутри октамера; сайт α1α1, который использует спираль α1 двух соседних гистонов, и сайт L1L2, образованный петлями L1 и L2. Солевые связи и водородные связи между основными и гидроксильными группами боковой цепи, а также амиды основной цепи с фосфатами основной цепи ДНК образуют основную часть взаимодействий с ДНК. Это важно, учитывая, что повсеместное распространение нуклеосом по геномам требует, чтобы они были неспецифическим для последовательности ДНК-связывающим фактором. Хотя нуклеосомы имеют тенденцию отдавать предпочтение одним последовательностям ДНК другим, [31] они способны связываться практически с любой последовательностью, что, как полагают, обусловлено гибкостью в формировании этих опосредованных водой взаимодействий. Кроме того, между боковыми цепями белка и группами дезоксирибозы возникают неполярные взаимодействия, а боковая цепь аргинина вставляется в малую бороздку ДНК во всех 14 сайтах, где она обращена к поверхности октамера. Распределение и сила сайтов связывания ДНК на поверхности октамера искажают ДНК внутри ядра нуклеосомы. ДНК неравномерно изогнута, а также содержит дефекты скручивания. Скрутка свободной B-формы ДНК в растворе составляет 10,5 п.н. на виток. Однако общий поворот нуклеосомной ДНК составляет всего 10,2 п.н. на оборот, варьируясь от значения от 9,4 до 10,9 п.н. на оборот.
Отростки гистоновых хвостов составляют до 30% массы гистонов, но не видны в кристаллических структурах нуклеосом из-за их высокой внутренней гибкости и считаются в значительной степени неструктурированными. [32] N-концевые хвосты гистонов H3 и H2B проходят через канал, образованный малыми бороздками двух цепей ДНК, выступая из ДНК каждые 20 пар оснований. N -концевой хвост гистона H4, напротив, имеет область высокоосновных аминокислот (16-25), которая в кристаллической структуре образует взаимодействие с высококислотной поверхностной областью димера H2A-H2B. другой нуклеосомы, что потенциально имеет отношение к структуре нуклеосом более высокого порядка. Считается, что это взаимодействие происходит и в физиологических условиях и предполагает, что ацетилирование хвоста H4 искажает структуру хроматина высшего порядка. [ нужна цитата ]
Организация ДНК, достигаемая нуклеосомой, не может полностью объяснить упаковку ДНК, наблюдаемую в ядре клетки. Дальнейшее уплотнение хроматина в клеточное ядро необходимо, но оно еще недостаточно изучено. В настоящее время известно [25] , что повторяющиеся нуклеосомы с промежуточной «линкерной» ДНК образуют волокно длиной 10 нм , описываемое как «бусинки на нитке», и имеют коэффициент упаковки примерно от пяти до десяти. [18] Цепочка нуклеосом может быть организована в волокно длиной 30 нм , компактную структуру с коэффициентом упаковки ~50 [18] , формирование которой зависит от присутствия гистона H1 .
Кристаллическая структура тетрануклеосомы была представлена и использована для создания предлагаемой структуры волокна диаметром 30 нм в виде двухзачатковой спирали. [33] До сих пор существуют определенные разногласия относительно этой модели, поскольку она несовместима с недавними данными электронной микроскопии . [34] Помимо этого, структура хроматина плохо изучена, но классически предполагается, что 30-нм волокно устроено в петли вдоль центрального белкового каркаса с образованием транскрипционно активного эухроматина . Дальнейшее уплотнение приводит к транскрипционно неактивному гетерохроматину .
Хотя нуклеосома представляет собой очень стабильный комплекс белок-ДНК, она не статична и, как было показано, претерпевает ряд различных структурных перестроек, включая скольжение нуклеосомы и обнажение участков ДНК. В зависимости от контекста нуклеосомы могут ингибировать или облегчать связывание факторов транскрипции. Положения нуклеосом контролируются тремя основными факторами: во-первых, внутренняя аффинность связывания октамера гистонов зависит от последовательности ДНК. Во-вторых, нуклеосома может быть вытеснена или рекрутирована за счет конкурентного или кооперативного связывания др. белковых факторов. В-третьих, нуклеосома может активно транслоцироваться с помощью АТФ-зависимых комплексов ремоделирования. [35]
Работа, проведенная в лаборатории Брэдбери, показала, что нуклеосомы, восстановленные в позиционирующей последовательности 5S ДНК, способны трансляционно перемещаться на соседние последовательности при термической инкубации. [36] Более поздние работы показали, что это изменение положения не требует разрушения октамера гистонов, но соответствует способности нуклеосом «скользить» вдоль ДНК в цис-положении . В 2008 году было дополнительно обнаружено, что сайты связывания CTCF действуют как якоря позиционирования нуклеосом, так что при использовании для выравнивания различных геномных сигналов можно легко идентифицировать множественные фланкирующие нуклеосомы. [37] Хотя нуклеосомы по своей природе подвижны, эукариоты развили большое семейство АТФ-зависимых ферментов ремоделирования хроматина, изменяющих структуру хроматина, многие из которых делают это посредством скольжения нуклеосом. В 2012 году лаборатория Бины Пиллаи продемонстрировала, что скольжение нуклеосом является одним из возможных механизмов крупномасштабной тканеспецифической экспрессии генов. Работа показывает, что сайт начала транскрипции генов, экспрессируемых в определенной ткани, истощен нуклеосомами, в то время как тот же набор генов в другой ткани, где они не экспрессируются, связан с нуклеосомами. [38]
Работа лаборатории Видома показала, что нуклеосомная ДНК находится в равновесии между завернутым и развернутым состоянием. Измерения этих скоростей с использованием FRET с временным разрешением показали, что ДНК внутри нуклеосомы остается полностью завернутой только в течение 250 мс, прежде чем она разворачивается в течение 10-50 мс, а затем быстро переворачивается. [39] Это означает, что ДНК не обязательно должна активно отделяться от нуклеосомы, но существует значительный промежуток времени, в течение которого она полностью доступна. Действительно, это можно распространить на наблюдение, что введение ДНК-связывающей последовательности внутри нуклеосомы увеличивает доступность соседних областей ДНК при связывании. [40] Эта склонность ДНК внутри нуклеосомы «дышать» имеет важные функциональные последствия для всех ДНК-связывающих белков, которые действуют в среде хроматина. [39] В частности, динамическое дыхание нуклеосом играет важную роль в ограничении продвижения РНК-полимеразы II во время элонгации транскрипции. [41]
Промоторы активных генов имеют свободные от нуклеосом области (NFR). Это обеспечивает доступность промоторной ДНК для различных белков, таких как факторы транскрипции. Свободная от нуклеосом область у S. cerevisiae обычно занимает 200 нуклеотидов [42]. Хорошо расположенные нуклеосомы образуют границы NFR. Эти нуклеосомы называются +1-нуклеосомой и -1-нуклеосомой и расположены на канонических расстояниях ниже и выше соответственно от места начала транскрипции. [43] +1-нуклеосома и несколько последующих нуклеосом также имеют тенденцию включать вариант гистона H2A.Z. [43]
Геномы эукариот повсеместно связаны с хроматином; однако клетки должны пространственно и временно регулировать специфические локусы независимо от объема хроматина. Чтобы достичь высокого уровня контроля, необходимого для координации ядерных процессов, таких как репликация, репарация и транскрипция ДНК, клетки разработали множество средств для локальной и специфической модуляции структуры и функции хроматина. Это может включать ковалентную модификацию гистонов, включение вариантов гистонов и нековалентное ремоделирование с помощью АТФ-зависимых ферментов ремоделирования.
С момента их открытия в середине 1960-х годов было предсказано, что модификации гистонов будут влиять на транскрипцию. [44] Тот факт, что большинство ранних обнаруженных посттрансляционных модификаций были сосредоточены в отростках хвостов, которые выступают из ядра нуклеосомы, приводит к двум основным теориям относительно механизма модификации гистонов. Первая из теорий предполагала, что они могут влиять на электростатические взаимодействия между хвостами гистонов и ДНК, «расслабляя» структуру хроматина. Позже было высказано предположение, что комбинации этих модификаций могут создавать связывающие эпитопы, с помощью которых можно рекрутировать другие белки. [45] Недавно, учитывая, что в структурированных областях гистонов было обнаружено больше модификаций, было высказано предположение, что эти модификации могут влиять на взаимодействия гистона с ДНК [46] и гистона с гистонами [47] внутри ядра нуклеосомы. Предполагается, что модификации (такие как ацетилирование или фосфорилирование), которые снижают заряд ядра глобулярного гистона, «ослабляют» ассоциацию ядро-ДНК; сила эффекта зависит от местоположения модификации внутри ядра. [48] Было показано, что некоторые модификации коррелируют с молчанием генов; другие, по-видимому, коррелируют с активацией генов. Общие модификации включают ацетилирование , метилирование или убиквитинирование лизина ; метилирование аргинина ; _ и фосфорилирование серина . _ Информация, хранящаяся таким образом, считается эпигенетической , поскольку она не кодируется в ДНК, но по-прежнему передается по наследству дочерним клеткам. Поддержание подавленного или активированного статуса гена часто необходимо для клеточной дифференцировки . [18]
Хотя гистоны удивительно консервативны на протяжении эволюции, было идентифицировано несколько их вариантов форм. Это разнообразие функций гистонов ограничивается H2A и H3, при этом H2B и H4 в основном инвариантны. H2A может быть заменен на H2AZ (что приводит к снижению стабильности нуклеосом) или H2AX (который связан с репарацией ДНК и дифференцировкой Т-клеток ), тогда как неактивные Х-хромосомы у млекопитающих обогащены макроH2A. H3 может быть заменен на H3.3 (который коррелирует с активирующими генами и регуляторными элементами), а в центромерах H3 заменяется на CENPA . [18]
Ряд различных реакций связан с термином АТФ-зависимое ремоделирование хроматина . Было показано, что ферменты ремоделирования скользят нуклеосомами вдоль ДНК, [49] разрушают контакты гистона с ДНК до такой степени, что дестабилизируют димер H2A/H2B [50] [51] и генерируют отрицательное сверхспиральное кручение в ДНК и хроматине. [52] Недавно было показано, что фермент ремоделирования Swr1 вводит вариант гистона H2A.Z в нуклеосомы. [53] В настоящее время неясно, представляют ли все это отдельные реакции или просто альтернативные результаты общего механизма. Что общего между всеми и действительно является отличительной чертой АТФ-зависимого ремоделирования хроматина, так это то, что все они приводят к изменению доступности ДНК.
Исследования, изучающие активацию генов in vivo [54] и, что еще более удивительно, ремоделирование in vitro [55], показали, что события ремоделирования хроматина и связывание транскрипционных факторов носят циклический и периодический характер. Хотя последствия этого для механизма реакции ремоделирования хроматина неизвестны, динамическая природа системы может позволить ей быстрее реагировать на внешние стимулы. Недавнее исследование показывает, что положения нуклеосом значительно изменяются во время развития эмбриональных стволовых клеток мыши, и эти изменения связаны со связыванием факторов транскрипции развития. [56]
Исследования 2007 года каталогизировали положения нуклеосом у дрожжей и показали, что нуклеосомы истощены в промоторных областях и местах начала репликации . [57] [58] [59] Около 80% генома дрожжей, по-видимому, покрыто нуклеосомами [60], и характер позиционирования нуклеосом явно связан с областями ДНК, которые регулируют транскрипцию , областями, которые транскрибируются, и областями, которые инициируют репликацию ДНК. . [61] Совсем недавно в новом исследовании изучались динамические изменения в репозиции нуклеосом во время глобального события транскрипционного перепрограммирования, чтобы выяснить влияние на смещение нуклеосом во время полногеномных транскрипционных изменений у дрожжей ( Saccharomyces cerevisiae ). [62] Результаты показали, что нуклеосомы, которые были локализованы в областях промотора, смещаются в ответ на стресс (например, тепловой шок ). Кроме того, удаление нуклеосом обычно соответствовало активации транскрипции, а замена нуклеосом обычно соответствовала репрессии транскрипции, предположительно потому, что сайты связывания транскрипционных факторов становились более или менее доступными соответственно. В общем, только одна или две нуклеосомы были перемещены в промоторе, чтобы вызвать эти транскрипционные изменения. Однако даже в хромосомных регионах, которые не были связаны с транскрипционными изменениями, наблюдалось репозиционирование нуклеосом, что позволяет предположить, что покрытие и раскрытие транскрипционной ДНК не обязательно приводит к транскрипционному событию. После транскрипции область рДНК должна быть защищена от любых повреждений. Предполагается, что белки HMGB играют важную роль в защите свободной области нуклеосомы. [63] [64]
Дефекты скручивания ДНК — это когда добавление одной или нескольких пар оснований из одного сегмента ДНК переносится на следующий сегмент, что приводит к изменению скручивания ДНК. Это не только изменит скручивание ДНК, но и изменит длину. [65] Этот дефект скручивания в конечном итоге перемещается вокруг нуклеосомы посредством переноса пары оснований, это означает, что скручивания ДНК могут вызывать скольжение нуклеосомы. [66] Кристаллические структуры нуклеосом показали, что в местах суперспирали 2 и 5 нуклеосомы обычно возникают дефекты скручивания ДНК, поскольку они являются обычными сайтами связывания ремоделеров. [67] Существует множество ремоделаторов хроматина, но все они имеют общий двигатель АТФазы, который облегчает скольжение хроматина по ДНК посредством связывания и гидролиза АТФ. [68] АТФаза имеет открытое и закрытое состояние. Когда двигатель АТФазы переходит из открытого в закрытое состояние, дуплекс ДНК меняет геометрию и демонстрирует наклон пары оснований. [67] Инициирование дефектов скручивания посредством мотора АТФазы вызывает накопление напряжения вокруг сайта ремоделирования. Напряжение снимается, когда скольжение ДНК завершено по нуклеосоме за счет распространения двух дефектов скручивания (по одному на каждой нити) в противоположных направлениях. [68]
Нуклеосомы можно собирать in vitro с использованием очищенных нативных или рекомбинантных гистонов. [69] [70] Один из стандартных методов загрузки ДНК вокруг гистонов включает использование солевого диализа . Реакцию, состоящую из октамеров гистонов и обнаженной матрицы ДНК, можно инкубировать вместе при концентрации соли 2 М. При постепенном уменьшении концентрации соли ДНК придет в равновесие до положения, в котором она обертывается вокруг октамеров гистонов, образуя нуклеосомы. В соответствующих условиях этот процесс восстановления позволяет экспериментально картировать аффинность позиционирования нуклеосом данной последовательности. [71]
Недавний прогресс в производстве ядерных частиц с повышенной стабильностью включает в себя сайт-специфические дисульфидные сшивки. [72] В ядро нуклеосомной частицы можно ввести две разные поперечные связи. Первый связывает две копии H2A посредством введенного цистеина (N38C), в результате чего образуется октамер гистонов , который устойчив к потере димера H2A/H2B во время восстановления нуклеосомы. Вторая сшивка может быть введена между N-концевым хвостом гистона H3 и концами нуклеосомной ДНК посредством встроенного конвертируемого нуклеотида. [73] Сшивка октамера ДНК-гистон стабилизирует ядро нуклеосомной частицы против диссоциации ДНК при очень низких концентрациях частиц и при повышенных концентрациях соли.
Нуклеосомы — это основная единица упаковки геномной ДНК, построенная из белков-гистонов, вокруг которых свернута ДНК. Они служат основой для формирования структуры хроматина более высокого порядка, а также слоем регуляторного контроля экспрессии генов. Нуклеосомы быстро собираются на вновь синтезированной ДНК за репликационной вилкой.
Гистоны H3 и H4 из разобранных старых нуклеосом остаются поблизости и случайным образом распределяются по вновь синтезированной ДНК. [74] Они собираются комплексом фактора сборки хроматина 1 (CAF-1), который состоит из трех субъединиц (p150, p60 и p48). [75] Недавно синтезированные H3 и H4 собираются с помощью фактора сборки репликационной связи (RCAF). RCAF содержит субъединицу Asf1, которая связывается с вновь синтезированными белками H3 и H4. [76] Старые белки H3 и H4 сохраняют свои химические модификации, что способствует передаче эпигенетической сигнатуры. Вновь синтезированные белки H3 и H4 постепенно ацетилируются по различным остаткам лизина в рамках процесса созревания хроматина. [77] Также считается, что старые белки H3 и H4 в новых нуклеосомах привлекают ферменты, модифицирующие гистоны, которые маркируют новые гистоны, способствуя эпигенетической памяти.
В отличие от старых H3 и H4, старые белки-гистоны H2A и H2B высвобождаются и разрушаются; следовательно, вновь собранные белки H2A и H2B включаются в новые нуклеосомы. [78] H2A и H2B собираются в димеры, которые затем загружаются на нуклеосомы с помощью белка сборки нуклеосомы-1 (NAP-1), который также способствует скольжению нуклеосом. [79] Нуклеосомы также разделены АТФ-зависимыми комплексами ремоделирования нуклеосом, содержащими ферменты, такие как Isw1 Ino80 и Chd1, и впоследствии собираются в структуру более высокого порядка. [80] [81]
Кристаллическая структура коровой частицы нуклеосомы ( PDB : 1EQZ [ 28] ) — разные виды, показывающие детали сворачивания и организации гистонов. Гистоны H2A , H2B , H3 , H4 и ДНК окрашены.